ферментативная активность каталазы

Ферментативная активность каталазы

Принцип метода Каталаза- это фермент, который встречается в организме человека преимущественно в печени и эритроцитах. Он разлагает перекись водорода, токсический побочный продукт клеточного дыхания, на воду и кислород.

2H₂O₂ ^{каталаза} 2H₂O + O₂

Подготовка эксперимента

1. Положить печень цыпленка в ступку, пестиком измельчить ткань печени до однородного состояния, постепенно добавить воду (общий объем воды 10 мл). Полученный сок профильтровать через сито.

2. 1 мл полученного « печеночного сока» налить в пенициллиновый флакон и поместить в водяную баню на 5 минут.

3. 1 мл полученного « печеночного сока» налить в пенициллиновый флакон и поместить в поддон со льдом до проведения эксперимента.

Эксперимент № 1 «Изучение ферментативной активности каталазы»:

Порядок выполнения

1.Налить 10 мл 3% раствора перекиси водорода в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.

2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (как показано на рисунке).

3. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой ( предварительно смазанной глицерином).

4. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).

5. Включить магнитную мешалку.

6. Зарисовать в тетрадь полученный график.

Наблюдения и результаты:

В колбе наблюдается отчетливое выделение пузырьков с кислородом. Кривая давления резко возрастает, но затем вертикально падает, из-за того, что резиновую пробку выбило давлением с колбы.

Эксперимент №2 «Влияние щелочной среды на активность фермента»:

1.Налить 10 мл 3% раствора перекиси водорода в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.

2. Добавить 10 мл 1 молярного раствора NaOH.

3. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (как показано на рисунке).

4. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой ( предварительно смазанной глицерином).

5. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).

6. Включить магнитную мешалку.

7. Зарисовать в тетрадь полученный график.

Наблюдения и результаты:

Визуально реакция протекает слабее. Кривая давления возрастает гораздо менее резко, чем при нормальных условиях, что говорит о снижении активности фермента при сдвиге рН в щелочную сторону.

Эксперимент №3: «Влияние кислой среды на активность фермента»:

1.Налить 10 мл 3% раствора перекиси водорода в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.

2. Добавить 10 мл 1 молярного раствора HCI.

3. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (как показано на рисунке).

4. Добавить 1 мл « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой

( предварительно смазанной глицерином).

5. Немедленно начать измерения (время работы 60 сек).

6. Включить магнитную мешалку.

7. Зарисовать в тетрадь полученный график.

Наблюдения и результаты:

Выделение пузырьков кислорода не наблюдается, давление в колбе остается постоянным. Кривая давления не возрастает, что говорит об отсутствии активности каталазы в кислой среде.

Эксперимент №4 «Влияние высокой температуры на активность фермента»:

1.Налить 10 мл 3% раствора перекиси водорода в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.

2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (как показано на рисунке).

3. Добавить 1 мл « печеночного сока», предварительно прогретого на водяной бане и немедленно закрыть колбу пробкой (смазанной глицерином).

4. Немедленно начать измерения (время работы 60 сек).

5. Включить магнитную мешалку.

6. Зарисовать в тетрадь полученный график.

Наблюдения и результаты:

Выделение пузырьков кислорода не наблюдается. Кривая давления не возрастает, что говорит о потере ферментом своей активности при нагревании, вследствие денатурации.

Эксперимент №5 «Влияние низкой температуры на активность фермента»:

1.Налить 10 мл 3% раствора перекиси водорода в цилиндр объемом 100 мл и добавить 50 мл дистиллированной воды.

2. Вылить получившийся раствор в колбу Эрленмейера, положить в нее брусок для магнитной мешалки, поставить колбу на магнитную мешалку, зафиксировать горловину зажимом (как показано на рисунке).

3. Добавить 1 мл охлажденного « печеночного сока» и немедленно закрыть колбу пробкой (смазанной глицерином).

4. Немедленно начать измерения (время работы 120 сек).

5. Включить магнитную мешалку.

6. Зарисовать в тетрадь полученный график.

Наблюдения и результаты:

В колбе наблюдается отчетливое выделение пузырьков с кислородом. Кривая давления резко возрастает, но затем вертикально падает, из-за того, что резиновую пробку выбило давлением с колбы. Резкое охлаждение, в отличие от нагревания, деактивирует каталазу лишь временно. Когда температура повышается, фермент снова начинает нормально работать.

Клинико-диагностическое значение:

1. Антисептические и противомикробные свойства перекиси водорода: водный раствор перекиси водорода часто используют для очищения ран и гнойников. Основным принципом действия препарата является обильное освобождение кислорода под действием каталазы крови, что приводит к механическому очищению, дезинфекции поверхности.

2. На пероксидазном действии крови основаны качественные реакции ( например, реакция Грегерсена) обнаружения крови в моче, кале, желудочном соке, рвотных массах и других средах, а также на различных предметах, инструментарии и т.п.

3. Знания о термолабильности ферментов учитывается в практической медицине в следующих случаях:

● Гипертермия используется для как метод лечения некоторых патологических процессов, например в онкологии. Температурная деструкция белков применяется в хирургии (коагуляторы), при обеззараживании медицинских инструментов и средств ухода;

● гипотермия используется для снижение интенсивности метаболических процессов при выполнении тяжелых хирургических манипуляций с целью уменьшения осложнений (кардиохирургия); криоконсервация позволяет сохранять жизнеспособность органов и тканей при трансплантации, консервировать стволовые, половые клетки, пуповинную кровь, эмбрионы.

4. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны рН. рН крови человека колеблется в пределах от 7,37 до 7,43, а изменение этих значений всегда критично для витальных функций организма. Сдвиг рН в кислую сторону называется АЦИДОЗ, в щелочную – АЛКАЛОЗ. Оба этих патологических состояния требуют немедленного оказания медицинской помощи.