5. Полезное увеличение микроскопа

В световой микроскопии используют понятие «полезное увеличение микроскопа» - отношение предела разрешения для глаза к пределу разрешения для микроскопа: . Напоминаю, что нормальный глаз в предельном случае различает две точки предмета, угол зрения для которых равен 1′. Считают, что удобная различимость соответствует углу зрения в интервале от 2′ до 4′, при этом размеры объекта на расстоянии наилучшего зрения составляют от 140 до 280 мкм. Подставив эти значения, а также λ = 555 нм, находим интервал значений полезного увеличения микроскопа.

500А < Г < 1000A

Это увеличение называют полезным, так как при нем глаз различает все элементы структуры предмета, разрешенные микроскопом. Для микроскопов с масляной иммерсией 700А < Г < 1400A.

6. Аберра́ции оптических систем

Аберрации оптических систем - ошибки или погрешности изображения в реальной оптической системе, вызываемые отклонением луча от того направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе. Основные аберрации линз:

сферическая аберрация – периферические части линзы сильнее отклоняют лучи, чем центральные. Заметное влияние на сферическую аберрацию оказывает диафрагмирование объектива (или иной оптической системы), так как при этом отсекаются краевые лучи широкого пучка.

хроматическая аберрация – связана с тем, что показатель преломления вещества, из которого изготовлена линза, зависит от длины волны падающего света. Поэтому фокус линзы для света разной длины различен. Хроматические аберрации ведут к снижению чёткости изображения, а иногда также и к появлению на нём цветных контуров, полос, пятен, которые у предмета отсутствуют. Хроматизм может быть исправлен путем комбинирования собирательной и рассеивающей линз из стёкол с различной дисперсией.

дисто́рсия — аберрация оптических систем, при которой линейное увеличение изменяется по полю зрения. При этом нарушается подобие между объектом и его изображением (подушкообразная дисторсия, бочкообразная дисторсия). Возникает вследствие того, что лучи, посылаемые предметом в систему, составляют большие углы с оптической осью. Подбирая систему из нескольких линз с противоположным характером дисторсии, можно исправить эту аберрацию.

астигматизм – аберрация, обусловленная неодинаковым преломлением лучей в различных меридианных плоскостях (меридианной плоскостью называется плоскость, проходящая через главную оптическую ось линзы). Астигматизм может быть обусловлен отклонением поверхности линзы от правильной сферической формы, а также большим углом наклона лучей к главной оптической оси линзы (астигматизм косых пучков).

7. Некоторые специальные приемы оптической микроскопии

а) Измерение размеров микрообъектов при помощи окулярного винтового микрометра

Для этого применяют окулярный микрометр – круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются и можно определить, сколько делений шкалы укладывается на измеряемом объекте. Отсчет по шкале еще не дает размера объекта, так как совмещаемое со шкалой изображение не равно размеру предмета. Нужно найти цену деления окулярного микрометра. Для этого применяют объект-микрометр – шкалу с делениями по 0,01 мм. Рассматривая объект-микрометр как предмет, совмещают в одном поле зрения две шкалы – объект-микрометра и окулярного микрометра – и определяют цену деления окулярного микрометра. Вместо объект-микрометра можно использовать любой объект, размер которого известен, или использовать счетную камеру Горяева, употребляемую для подсчета форменных элементов крови.

б) Микропроекция и микрофотография

Формирование микроскопического изображения происходит с участием человека и завершается образованием действительного изображения в глазу. Обычный микроскоп сам по себе не создает действительного изображения, однако оно необходимо для микрофотографирования или проекции микроскопического изображения на экран (микропроекция). Для этого изображение, даваемое объективом, следует разместить от окуляра, на расстоянии, превышающем его фокусное расстояние.

в) Метод фазового контраста

Метод фазового контраста и его разновидность — так называемый метод «аноптрального» контраста - предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху

г) Ультрамикроскопия

Это метод обнаружения частиц, размеры которых лежат за пределом разрешения микроскопа. В ультрамикроскопах осуществляют боковое (косое) освещение, благодаря чему субмикроскопические частицы видны как светлые точки на темном фоне; строение частиц увидеть нельзя. Этот метод позволяет регистрировать частицы размером до 2 мкм, и его используют, в частности, с санитарно-гигиеническими целями для определения чистоты воздуха.

д) Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

е) Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что луч света раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста — они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

Ж) Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

Выводы и заключение

На сегодняшней лекции мы познакомились со световым микроскопом – устройством, которое успешно используется в биологии и медицине уже на протяжении более чем 300 лет. Тем не менее, приемы световой микроскопии постоянно совершенствуются и находят все новые и новые применения.

Например, всем понятна важность анализов крови при различных заболеваниях, в том числе подсчета числа форменных элементов. Однако не так давно учёные пришли к выводу, что еще более важной может быть не количественная, а качественная оценка форменных элементов крови и плазмы.

Для этого используется фазово-контрастная микроскопия - передовой метод диагностики живой капли крови, изображение которой передаётся на экран монитора компьютера с помощью цифровой телевизионной камеры, подключённой к микроскопу, и может быть захвачено и сохранено в стандартном графическом формате (*.jpg) или записано в виде ролика, который  сможет просмотреть специалист и обследуемый пациент. Наглядность такого метода намного выше, чем длинные столбцы цифр или абзацы текста.

На основании сканирования живой капли крови определяется: 1) состояние эритроцитов, их подвижность в плазме, степень агрегации (склеивание в "монетный столбик") и сладжирование (образование беспорядочной, сплошной агрегации). Анализируя состояние тромбоцитов, лимфоцитов и лейкоцитов, можно определить активность иммунной системы и способность организма к самовосстановлению, а также патологические изменения состава крови, приводящие к развитию многих заболеваний. 2) Наличие кристаллов холестерина, сахара, мочевой кислоты и др., включая дрожжевую и бактериальную инфекцию 3) Состояние жидкой части крови (плазмы), степень её чистоты, наличие или отсутствие микроорганизмов, физиологических (холестерин) и/или патологических включений.

Спектр диагностики заболеваний очень широкий и позволяет сделать заключение о состоянии обмена веществ (жирового, белкового, углеводного, фосфорно-кальциевого), который зависит от работы поджелудочной железы, печени; о нарушениях, которые могут привести к анемии, атеросклерозу, подагре, онкологическим заболеваниям; о состоянии иммунитета и дисбактериозе кишечника, наличии в организме паразитов. При недостатке в организме витаминов группы В, фолиевой кислоты и железа на экране монитора можно увидеть отдельно расположенные округлые эритроциты разных размеров. О наличии в организме свободных радикалов, поражающих клетки крови, свидетельствует наличие эритроцитов, имеющих повреждения в виде "обкусанных" краев. В состоянии почти сплошного склеивания (сладжа) эритроциты выполняют свою функцию всего лишь на 10%, т.е. организм не получает в достаточном количестве питательных веществ, витаминов, кислорода, из клеток не выводятся шлаки. Отсюда - плохой сон, усталость, в конечном итоге - синдром хронической усталости, ослабленный иммунитет и ряд сопутствующих заболеваний.

«___» __________ 20__ г.

Исполнитель: Доцент Новикова Н.Г.