2.5.2 Выбор подвижной фазы и условий разделения.

Ионообменное, разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства. Иногда добавляют в ПФ небольшое количество смешивающихся с водой органических растворителей – метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана. Сила и селективность растворителя зависят от типа и концентрации буферных ионов и других солей, от значения рН и от вида и

концентрации добавленных органических растворителей.

Удерживание в ионообменной хроматографии зависит от двух процессов: распределения образца между водной подвижной фазой и органической неподвижной и образования ионных пар (т.е. анионного или катионного обмена), причем последний процесс доминирует. Сила электростатического взаимодействия заряженных ионизированных групп вещества с заряженными группами ионообменника влияет на распределение вещества между фазами. Некоторые гидрофобные соединения или вещества, способные образовывать водородные связи, могут

взаимодействовать с материалом матрицы неспецифически.

Степень удерживания образца снижается с увеличением ионной силы подвижной фазы и увеличивается с увеличением ионообменной емкости сорбента. Ионная сила подвижной фазы возрастает при возрастании концентрации буфера и сохранении неизменным рН или при добавлении соли. Важна также концентрация буферных растворов, так как в растворе наблюдается конкуренция между ионами образца и буфера. Уменьшение концентрации буферного раствора увеличивает сродство смолы к образцу, что приводит к увеличению времени удерживания. Концентрация буферного раствора обычно находится от 0,001 до 6 моль/л, причем верхняя граница определяется растворимостью соли, используемой в качестве буфера, а нижняя – самой буферной силой, так как в слабом буферном растворе нельзя контролировать уровень рН. Сильных буферных растворов также следует избегать, так как возможно выпадение осадка и забивание колонок. В ионообменной хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный, формиатный, аммиачный, боратный. Селективность разделения в ионообменной хроматографии зависит от концентрации и вида буферных ионов и органических растворителей, а также от рН среды.

Биохимические пробы принято разделять при низких температурах, часто при 4 °С, хотя в современной ВЭЖХ при быстрых разделениях вероятность разрушения образца при 20–30 °С резко снижается. Повышение температуры может привести к снижению k' для всех компонентов образца, а снижение ионной силы подвижной фазы может привести к обратному явлению. Вводимые количества образца не должны превышать 5 % суммарной ионообменной емкости. Так, для соединений с молекулярной массой 200–500 предполагается введение около 50 мг пробы на 1 г полимерного сорбента.

Желательно, чтобы вводимый объем образца не превышал 1/3 объема

первого интересующего пика.

2.5.3 Проведение испытания

Цель занятия: ознакомление с ионообменным методом ВЭЖХ определения количественного содержания и состава углеводов в медах с использованием метода внешнего стандарта или абсолютной калибровки

Сущность метода.

Сущность метода заключается в извлечении углеводов из навески меда водой и определении их состава и количественного содержания на жидкостном хроматографе с рефрактометрическим детектором методом ионообменного элюирования с использованием калибровочного графика стандартов.

Материалы и оборудование.

1. Хроматограф жидкостной с насосом Waters1525EFи рефрактометрическим детекторомWaters2414 с диапазоном измерения по коэффициенту рефракции 1-1,75RIU

2. Колонка хроматографическая стальная Sugar–Pak, размером 6.5×300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме.

3. Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43-45 кГц.     

4. Весы лабораторные по ГОСТ 24104с пределами абсолютной погрешности однократного взвешивания ±0,1 мг.

5. Фильтры с размером пор 0,45 мкм, диаметром 13 мм.

6. Элюент 0,0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.

7. Глюкоза кристаллическая гидратная , х.ч. по Гост 975-88.

8. Фруктоза кристаллическая, х.ч.имп.

9. Вода деионизованная с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см.

Построение градуировочных графиков для стандартов глюкозы и фруктозы.

(1,0+0,0005) г стандартного образца препарата глюкозы растворяют в деионизованной воде в колбе вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают. Получают основной стандартный раствор глюкозы с содержанием 10 мг/мл.

Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 1 мг; 5 мг; 10мг; 15мг; 20 мг глюкозы в 100 мл соответственно. Для этого берут соответственно 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают.

Аналогичным образом готовят рабочие стандартные растворы для препарата фруктозы.

Растворы пригодны в день приготовления.

Рабочие стандартные растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:

– хроматографическая колонка стальная Sugar–Pak, размером 6,5×300 мм, наполненная микрокристаллическим катионообменным гелем в кальциевой форме;

– подвижная фаза 0,0001 М раствор кальция ЭДТА (кальциевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты), приготовленный на воде с удельным сопротивлением 2 мега Ом*см;

– объем пробы 20 мкл;

– скорость подачи элюента 0,5 мл/мин;

– температура хроматографической колонки 80°С;

– температура детектора 50°С;

Время выхода хроматографического пика глюкозы составляет 9,5 мин, фруктозы 11,4 мин.

Каждый раствор хроматографируют по 2 раза и строят калибровочные графики для глюкозы и фруктозы соответственно, откладывая по оси ординат значения площадей хроматографических пиков, по оси абсцисс – значения содержания глюкозы или фруктозы в мг в 100 мл раствора.

Проверка градуировочных графиков.

Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора стандартов глюкозы и фруктозы хроматографируют при выше указанных условиях. Отклонения полученных результатов (площадь хроматографических пиков) от измеренных в момент построения градуировочного графика, А %, определяют по формуле (1)

(1)

где, S₁иS₂–площади хроматографических пиков, определенные при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно.

При отклонении результатов более, чем на 5 %, строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам препарата глюкозы и фруктозы.

Проведение анализа

Навеску меда массой 1 г, взвешенную с погрешностью не бо­лее 0,0005 г, помещают в стаканчик вместимостью 100 мл, приливают 50 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Затем раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят этим же растворителем до метки и перемешивают.

1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят до метки деионизованной водой и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм и используют для хроматографирования.

Подготовку проб проводят в двух параллелях.

Хроматографирование

Полученные испытуемые растворы хроматографируют по 2 раза. На хроматограммах испытуемых растворов находят площади хроматографических пиков сахаров глюкозы и фруктозы, рассчитывают среднее значение площадей и по градуировочномым графикам определяют содержание соответствующих сахаров в 100 мл в мг.

Хроматографирование испытуемых растворов осуществляют в тех же условиях, что и стандартные растворы, при построении калибровочных графиков.

Обработка результатов испытания.

Содержание сахаров глюкозы (Х₁) и фруктозы (Х₂) в испытуемых образцах в мг/г определяют по формуле (2):

;

(2)

Где, С₁(С₂) –содержание сахаров глюкозы и фруктозы в 100 мл, найденное по калибровочным графикам, в мг соответственно,;

m- масса навески меда, г;

100- разведение

Результат определения вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми при доверительной вероятности Р=0,95 не должно быть более 10 % относительно среднего арифметического значе­ния .