22. Получение изолимонной кислоты

22. Производство изолимонной кислоты.

Изолимонная кислота является ценным химическим препаратом, она используется пока только при биохимических исследованиях. Способность продуцировать эту кислоту широко распространена у различных видов дрожжей рода Candida (C.lipolytica, C. Guilliermondii, C. oleophila, C. Parapsilosis, C. tropicalis, C. zeylanoides). Все без исключения природные штаммы дрожжей при росте на средах с алканами продуцируют лимонную и трео- D_s-изолимонную кислоту, которые являются изомерами и различаются положением гидроксильной группы:

Н

|

HO --- C --- COOH

|

H C --- COOH

|

H₂ C --- COOH

Наиболее активными продуцентами оказались дрожжи вида C.lipolytica. Основным условием сверхсинтеза этой кислоты дрожжами является лимитирование роста одним из компонентов среды (азотом, фосфором, серой или магнием) при избыточном содержании источника углерода (парафина). В процессе ферментации можно различить две фазы: 1) фазу активного роста продуцента (сопровождающуюся полным потреблением источника азота); 2) фазу замедления роста и интенсивного синтеза изомеров лимонной кислоты. Процесс кислотообразования продолжается неразмножающимися клетками до полного потребления парафина из среды. Суммарный выход изомеров лимонной кислоты достигает 150% от массы внесенного парафина. В результате обработки природного штамма C.lipolytica, продуцирующего равные количества цитрата и изоцитрата, мутагенами и последующего отбора удалось получить две группы мутантов. Одна группа утратила способность продуцировать изолимонную кислоту при росте на среде с алканами и синтезировала практически только лимонную кислоту. Вторая группа мутантов при тех же условиях культивирования продуцировала преимущественно изолимонную кислоту.

За рубежом изолимонную кислоту получают путем сложного синтеза, результатом которого является рацемическая смесь d и l-форм кислоты. Биологической активностью обладает только d-форма (трео- D_s-изолимонная кислота). Высокая стоимость препарата определяется сложностью метода химического синтеза и последующего выделения изолимонной кислоты. С помощью мутантного штамма C.lipolytica – продуцента d-изоцитрата разработан простой метод получения этого важного биохимического реагента из н-алканов.

Накопление цитрата и изоцитрата может быть объяснено высокой активностью в клетках продуцента цитратсинтазы в сравнении с относительно низкими активностями последующих ферментов ЦТК и в первую очередь изоцитратдегидрогенизы. Непрерывное образование и выделение в среду в лимонной и изолимонной кислот в период лимитирования роста дрожжей источником азота может обеспечиваться функционированием глиоксилатного шунта.

Результаты анализа активностей ферментов и применения ингибиторов отдельных ферментов позволяют также предположить, что соотношение накапливаемых кислот лимонной и изолимонной определяется соотношением активностей аконитатгидратазы, изоцитратдегидрогеназы, а также изоцитрат-лиазы. Снижение активности аконитатгидратазы и повышения активности изоцитрат-лиазы приводит к преимущественному накоплению цитрата.