3. Лаборатория. Вгу

1. Цель и задачи исследования

Целью данной работы было выявление у бактерии рода Azospirillum thiophilum BV-S способности к росту в присутствии С1- соединений, как единственного источника углерода.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. Анализ драфт-генома у Azospirillum thiophilum BV-S: выявление метаболического потенциала усвоения C1-соединений: формиата.

2. Опредление активности формиатдегидрогеназы - фермента, участвующего в превращении формиата.

2. Объекты и методы исследования

Объектом исследования служил штамм Azospirillum thiophilum BV-S. Данный организм был выделен из умеренно-термального сероводородного источника «Бесстыжие ванны», расположенного в городе Пятигорске Ставропольского края.

Ааэробное культивирование Azospirillum thiophilum BV-S.

Для культивирования Azospirillum thiophilum BV-S была использована жидкая PSS среда следующего состава: (NH4)2SO4 – 1 г/л, MgSO4 – 1 г/л, CaCl2 – 0,03 г/л, пептон – 2 г/л, сукцинат Na – 1 г/л. В среду перед посевом вносили набор витаминов и микроэлементов. А также жидкая PFS среда следующего состава: (NH4)2SO4 – 1 г/л, MgSO4 – 1 г/л, CaCl2 – 0,03 г/л, пептон – 2 г/л, HCOOH – 1 г/л.

Получение клеточной суспензии и ферментных препаратов.

Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры при 5000g и 4^оС в течение 30 минут. Клетки отмывали 0,1 М трис-HCl-буфером (pH 7.5) и осаждали при тех же режимах центрифугирования в течение 10 минут.

Для получения гомогената бактериальные клетки разрушали с помощью ультразвукового дезентегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Ватт и частоте 22 кГц в течение 3 раз по 30 секунд на льду. Супернатант получали после центрифугирования гомогената при 9000g и 4^оС в течение 30 минут (Грабович и др., 1998; Grabovich et all, 1999).

Методы определения активности фермента, участвующего в усвоении формиата – формиатдегидрогеназы.

Активность фермента определяли спектрофотометрически на СФ-26. Активность фермента формиатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически в супернатанте по восстановлению NAD⁺ и выделению NADH. Спектрофотометрические исследования с использованием NADH проводили при λ=340 нм. Состав реакционной смеси: фосфатный буфер с NADH (pH 7,0) – 2,5 мл, супернатант – 500 мкл, общий объем смеси 3 мл.

3.3 Полученные результаты и их обсуждение Аннотирование драфт-генома Azospirillum thiophilum bv-s.

На базе сиквенса драфт-генома с использованием методов биоинформатики был аннотирован геном Azospirillum thiophilum BV-S. При аннотированиии генома основное внимание было уделено выяснению наличия генов, отвечающих за синтез ферментов, участвующих в усвоении C1-соединений. Геномный сиквенс анализировали при помощи интернет-ресурса RAST (http://rast.nmpdr.org). Данный сервер используется для быстрой первичной аннотации генома с использованием технологии подсистем.

Аннотирование геномного сиквенса показало, что у Azospirillum thiophilum BV-S. есть гены, кодирующие ферменты, участвующие в превращении формиата до CO2. Гены находятся в одном опероне.

ВЫВОДЫ

1. В результате анализа генома Azospirillum thiophilum BV-S идентифицированы гены, детерминирующие фермент, участвующий в превращении формиата:

Ген	Сиквенс
Ген fdhM, кодирующий формиатдегидрогеназу-О, большую субъединицу	(MLIKKSSATSGGRHLARTLSRTLASATGVTVDRRAFLRSSGLAAGGAALASAMPFGMVKKADAATPAAAAGAPVKQVKSVCTHCSVGCTVLAEVQNGVWIGQEPAFDSPINLGSHCAKGASVREHAHGERRLRYPMKMVDGKWTRIGWDQAIEEVGSKLLAIREQSGPDSVFWLGSAKHSNEQAYLFRKFAALWGTNNVDHQARICHSTTVAGVANVWGYGAMTNSYNDIQKSRALFFIGSNAAEAHPVAMLHILKAKEQNNAPLIVADPRFTRTAAKADEYIRFRPGTDVALVWGILWHVLQNGWEDKDYIAKRVYGFDDIRAEVAKWTPEEVERVTGVPGSQLKRVARTLASNRPGTLVWCMGGTQHHIGNNNTRAYCVLQLALGNVGVAGGGTNIFRGHDNVQGATDFGVTSDSLPGYYGLAEGAWRHWARVWDVPYEDVLARFKDKKLMEATGIPVSRWFDGVLEAKENLDQPNPVKGMVFWGHAPNSQVRLPDMKKAMEKLELLVVVDPFPTMTAVLPDRKDNFYLLPAATQFETVGSRTASNRSVQWSDKIMEPLFESKVDHEIMYLFAKKFGFAGPLFKNIKVEGTVPVIEDITREWNRGMWSVGYTGQSPERLKLHMQHQATFDKTTLRAVGGPCDGEYFGLPWPCWGTPEMKHPGTANLYDTSLPVAEGGGAFRARFGVERNGVTLLAEGSYPEGSEIKDGYPEVTMAMLQKLGFDADLTAEELAVIQKIGGDKIGSVSWTTDLSGGIQRVAIKHGLNPPGNAKARCVAWNFPDPVPIHREPLYTPRRDLVASYPTYKDTKSWRVPTLYKSIQDRDVSKEYPIILTSGRLVEYEGGGDETRSNPWLAELQQDMFVELNPFDANNAGVKDGQMVWVEGPEKGKVKVKAMVTERVGRGVAFMPFHFGGVYQGQDLRSKYPAGADPIVLGEAANTATTYGYDSVTQMQETKTTL)
Ген fdhG, кодирующий формиатдегидрогеназу-О, γ субъединицу	(MEGHRMKQASMKSALAALLLGIGLAGGLALPAAAQSSVRVGGPVDQAVDRDAPPVPTEILGQSRADSWHGIRLGEQGTVSIPNKQAGVLIQSEGEAWRAVRNGPLSQYGSWVLGGILALLALFFLVRGRIRIDGPKTGRTIQRFNAFERGVHWMTAGSFVVLAFSGLNLLYGRHTLLPLIGPEPFAALSHYGKLAHNFLGFAFILGVVLIFVMWVGHNIPSRHDLTWFLKAGGLFSKGVHPPAHKFNGGQKVIFWSTVAGGAALGFTGVQLIFPFSFATLEELQLFQLAHAAIAVVMIAIILAHIYIGSIGMEGAFDAMGDGQVELQWAREHHSLWVEEVTGEKIHHGHHGTPAE)
Ген fdh, кодирующий формиатдегидрогеназу-О, железо-серную субъединицу	(MQETKTTLCRIQSAXSAGVXTMARMKFLCDAERCIECNACVTACKNENEVPWGVNRRRVVTINDGKPGERTISVACMHCSDAPCMAVCPVDCFYQTDEGVVLHNKDLCIGCGYCFYACPFGAPQYPQAGNFGTRGKMDKCTFCSGGPEADNSDAEFKKYGRNRLAEGKLPLCAEMCSTKALLAGDADKVSDIYRERVTARGFGSGAWGWGTAYQTKAGQERGQPGGSVFQGTGGPGGAAGGLPMQKQGL)
Ген, кодирующий специфичный шаперон	(MSNAVDHTVSPAVAEEELLRAQVYGLLARLLSRPPDAAFLTALGEMVGEGGEFGEALDQLAEAALTSDPAAVEEEFTTLFIGVGGSERTPYGSFYLTGFLNEKPLAELRGDMARLGIARADGVSEPEDHIAALFEMMAGLIGGDFAPEDGGAVGLDGQRIFYDRHIGSWAGRFFADLETSPSARFYRAVGAVGRSFLAVEARAFDLAA)

2. Показан рост Azospirillum thiophilum BV-S в среде, где единственным источником углерода выступал формиат;

3. С применением биохимических методов показана активность формиатдегидрогеназы. Активность фермента составила 16 нмоль/мин/мг. белка.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Пиневич А. В. Микробиология. Биология прокариотов. 2 том. / А. В. Пиневич // СПб.: С.-Петербургский университет, 2007. – 329 с.

2. Попов В.О., Родионов Н.В., Егоров А.М., Березин И.В. / NAD-зависимая формиатдегидрогеназа из метилотрофных бактерий. Изучение кинетической схемы действия, 1978.

3. Попов В.О., Шумилин И.А., Устинникова Т.Б., Ламзин В.С., Егоров С.А. / NAD-зависимая формиатдегидрогеназа метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101, 1990.

4. Janet B. Matsen, SongYang, LisaY. Stein, David Beck and Marina G. Kalyuzhnaya / Global molecular analyses of methane metabolism in methanotrophic alphaproteobacterium, Methilosinus trichosporium OB3b. Part I: transcriptomic study, 2013.

5. http://www.ibpm.ru/index.php?option=com_content&view=article&id=1&Itemid=2

6. http://www.ibpm.ru/index.php?option=com_xmap&sitemap=2&Itemid=4

7. http://www.icb.psn.ru

8. http://web.iteb.psn.ru/history.htm

9. http://web.iteb.psn.ru/lab.htm

10. http://www.prao.ru/descript/descr.php

11. http://www.prao.ru/radiotelescopes/telescopes.php

12. http://www.protres.ru/index.php?option=com_content&task=view&id=62&Itemid=64

13. http://www.psn.ru/index.php?option=com_content&view=article&id=43&Itemid=71