Нст-тест

Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности.Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонизирующих факторов сыворотки,так и дефектов самих клеток.(нарушения двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера).Для определения фагоцитарной активности используют стандартные штаммы непатогенных микроорганизмов (например стафилококки штамма 209,убитые бактериями, или аутофлора больного).

Тест с нитросиним тетразолием используется для выявления так называемых активированных гранулацитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций. К числу индикаторов этого явления относятся НСТ-тест. Поглощенные из раствора НСТ под влиянием окислительных процессов в клетке превращается в нерастворимый формазан. Последний определяется в клетке в виде темно-синих гранул.

Различают спонтанный и стимулированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток по крови больного, например под влиянием инфекции. Результаты стимулированного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro. Этот тест следует проводить при сниженном числе спонтанных НСТ-положительных клеток у больного, чтобы выявить наличие или отсутствие окислительного метаболизма.

. Методика исследования.

Необходимые реактивы и материалы. КН42ОРО44О, На42ОРО44О,NaCl,глюкоза, НСТ, гепарин, спирт, однопроцентный водный раствор метиленового зеленого, микропипетки, микроскоп.

Приготовление раствораа. Один процент 15м фосфатного буфера с рН 7,2 и 0,6 % раствора натрия хлора.

б. 0,1 % НСТ в изотоническом растворе натрия-хлора. Для получения красителя необходимо длительное перемешивание и подогревание в горячей воде. Растворы а. и б. фильтруют через бумажные фильтры и хранят в холодильнике при температуре 10 с в течение 2-4 недель. Непосредственно перед установкой теста смешивают равное количество растворов а и б, смесь нагревают до 30-37 с. Кровь из пальца больного берут пипеткой, промытой гепарином. В центрифужной пробирке смешивают 0,1 мл крови и подогретой смеси. Инкубация 25 мин в термостате при 37 с , затем 10 мин при комнатной температуре. Из верхнего слоя клеточного осадка готовят мазки, высушивают на воздухе 3-5 мин, фиксируют СН3-ОН затем окрашивают метиленовым зеленым в течение 10 мин. Препараты просматривают под микроскопом с иммерсией.

Постановка стимулированного нст-теста.

Гипарнизированную кровь инкубируют со стимулятором (двух миллиардная взвесь стафилококка - штамм 209 и др.) в равных количествах. Затем проводят вышеописанный тест.

Учет результатов.

В клинико-лабораторной практике при постановке теста распространение получил цитохимический учет результатов, основанный на микроскопическом определении процентного содержания нейтрофилов с гранулами формазана в цитоплазме. Обычно анализу подвергают 100-200 сегментоядерных нейтрофилов. Показатель индуцированного варианта реакции вычисляют как разницу процентного содержания поглотивших и восстановивших тетразолей клеток после действия фактора стимуляции по сравнению с данными, полученными до стимуляции.

Для количественной оценки активности теста все клетки делят на 4 группы. К нулевой группе относят нейтрофилы без гранул, в первую группу включают клетки с единичными гранулами или в которых площадь окраски занимает от 25 до 30%. Во вторую группу относят нейтрофилы цитоплазма которых на 30-70% занята гранулами формазана (2степ активность), в третью - нейтрофилы до 100% заполненные гранулами. Определяют число клеток, принадлежащих в зависимости от активности ферментов к каждому из типов. Это число умножают на номер типа. Сумма полученных произведений - показатель реакции.

Показатель НСТ-теста = 1а+2б+3с, где а, б, с -количество клеток соответственного типа.