Коноплева 2013

1.Сырьё экстрагируют 50% этанолом. Для нейтрализации органических кислот к раствору добавляют кальция гидрокарбонат (10:1). Экстракцию иридоидов проводят при нагревании.

2.После фильтрации сырье выбрасывают.

3.Отгонка спирта под вакуумом до водного остатка.

4.Для очистки от липофильных веществ водный раствор порциями обрабатывают петролейным эфиром, который затем выбрасывают.

5.Очищенный водный раствор пропускают через колонку с ок-

сидом алюминия для удаления фенольных соединений.

6. Полученный водный элюат упаривают досуха, остаток растворяют в небольшом количестве этанола, к которому прибавляют ацетон для осаждения полисахаридов, сапонинов и других балласт-

ных веществ.

7.Осадок балластных веществ отфильтровывают, а спиртоаце- тоновый раствор, содержащий сумму иридоидов, упаривают.

8.Выделение индивидуальных веществ проводят методом распределительной колоночной хроматографии.

В других случаях используют свойство иридоидов обратимо адсорбироваться на активированном угле. Иридоиды из растительного сырья экстрагируют водой с добавлением карбоната кальция (для нейтрализации и связывания свободных кислот). К полученному экстракту добавляют активированный уголь, который затем промывают водой для удаления свободных сахаров. Иридоиды с угля элюируют 50% (аукубин) или 70% (асперулозид) этанолом, элюат концентрируют упариваением.

Разделение очищенной фракции проводят хроматографически на колонках с полиамидным сорбентом, силикагелем, целлюлозой, препаративной тонкослойной хроматографией.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Для качественного определения иридоидов в ЛРС часто используют реактив Трим-Хилла.

Реактив Трим-Хилла: смесь кислот уксусной ледяной, хлористоводородной концентрированной, 0,2% -ного водного раствора меди сульфата (20:1:2).

К 1 мл спиртового извлечения из ЛРС прибавляют 0,5 мл реактива Трим-Хилла. Смесь нагревают на водяной бане 1-2 мин. При взаимодействии с этим реактивом иридоиды ряда аукубина дают голубое или синее окрашивание. С помощью этого реактива могут быть обнаружены асперулозид, гарпагид, монотропеин, тевирикозид.

93

Несмотря на то, что эта реакция является общепринятой, некоторые иридоиды (например, вербеналин, логанин, плюмирид) ею не выявляются. В аналитической практике находит применение реактив Шталя, с которым реагирует большинство веществ иридоидной природы. Иридоиды группы аукубина с этим реативом дают синюю или голубую окраску.

Реактив Шталя: n-диметиламинобензальдегид – 1г, концентрированная хлористоводородная кислота – 5 мл, этанол – до 100 мл.

Реактив Бэкон-Эдельмана: бензидин – 0,5 г, трихлоруксусная кислота – 10 г, этанол – до 100 мл.

Иридоиды с этим реактивом окрашиваются от лимонно-желтого до коричневого цвета.

С вербеналином – фиолетовая окраска,

саукубином – лимонно-жёлтая,

скаталполом – коричневая окраска в видимом свете с интенсивной жёлтой флуоресценцией в УФ - свете.

Реактив Година: ванилин – 1 г, 3% водный раствор хлорной кислоты – 50 мл, этанол – до 100 мл.

Логанин с этим реактивом даёт окрашивание от красного до фиолетового.

Обнаружение аукубина: кусочек растительного материала помещают на фильтровальную бумагу, смачивают каплей реактива Шталя, через 2-3 мин сырьё снимают с бумаги и место с реактивом прогревают струёй горячего воздуха (90-100°С). При наличии аукубина наблюдают появление на бумаге голубого пятна (при наличии в сырье проазуленов образуется пятно зеленого цвета).

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Для более достоверного суждения о содержании иридоидов используют бумажную и тонкослойную хроматографии. Системы растворителей:

для БХ: Н-БУТАНОЛ - УКС. КИСЛОТА - Н2О (4:1:5); Н-БУТАНОЛ - МЕТАНОЛ - Н2О (4:1:5); ПРОПАНОЛ - Н2О (4:1);

для ТСХ: ЭТАНОЛ - ХЛОРОФОРМ (1:1); ЭТИЛАЦЕТАТ-МЕТАНОЛ и др. (4:1).

94

Для обнаружения иридоидов на хроматограммах используют 3% спиртовые растворы серной, соляной, трихлоруксусной кислот, реактивы Трим-Хилла, Шталя, Бэкон-Эдельмана и др.

После проявления хроматограммы выдерживают 5 - 10 мин в сушильном шкафу при температуре 110°С.

Иридоиды аукубинового ряда проявляются реактивами ТримХилла и Шталя в виде синих, зелёных и фиолетовых пятен.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЛРС

Для определения количественного содержания иридоидов в ЛРС используют колориметрические, спектрофотометрические, хроматоспектрофотометрические методы, а также ВЭЖХ.

Способ 1: Навеску (0,2 г) измельченного растительного сырья перемешивают с небольшим количеством карбоната кальция и трижды экстрагируют этанолом по 3 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Полученный экстракт фильтруют, упаривают досуха. Остаток обрабатывают петролейным эфиром. К очищенному остатку прибавляют 5-10 мл воды и раствор фильтруют через колонку (1х10 см) с нейтральным оксидом алюминия, после чего колонку промывают водой до получения 20 мл фильтрата.

1 мл полученного фильтрата смешивают с 0,5 мл реактива Трим-Хилла, 2,5 мл 50% уксусной кислоты и нагревают 15 мин при 70°С. Полученный раствор синего цвета охлаждают, перемешивают в течение 5 мин и измеряют оптическую плотность при 570 нм.

Способ 2: 0,2 г измельченного растительного сырья смешивают с 2 мг карбоната кальция и экстрагируют 3 раза по 10 мл 50% метанола при нагревании на водяной бане с обратным холодильником. Обьединенные экстракты выпаривают досуха, остаток для удаления липофильных веществ обрабатывают петролейным эфиром. Очищенный остаток растворяют в 5-10 мл воды, полученный раствор фильтруют через колонку (2 х 1 см) с оксидом алюминия, которую затем промывают водой до получения 20 мл элюата.

К 1 мл очищенной суммы иридоидов прибавляют 0,5 мл реактива Трим-Хилла, 2,5 мл 50% водного раствора уксусной кислоты и нагревают 15 мин на водяной бане при 70°С. Полученный синий раствор охлаждают в течение 5 мин и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при желтом светофильтре (570 нм).

Количественное содержание иридоидов в ЛРС можно определить общепринятыми физико-химическими методами.

Тем не менее, когда исследуют чистые горечи, в первую очередь устанавливают показатель горечи (ГФ РБ II, (2.8.15.)).

95

Горечь в растительном сырье определяют путём сравнения порога концентрации горечи в экстракте из растительного сырья со стандартным раствором хинина гидрохлорида.

Порог чувствительности горечи – это наименьшая концентрация раствора, которая позволяет ощутить горечь в течение 30 с.

Показатель горечи – величина обратная максимальному разведению исследуемого вещества, жидкости или экстракта, в которых еще ощущается горький вкус. Он определяется сравнением с хинина гидрохлоридом, разведение которого 200 000 не имеет горького вкуса.

ЗАГОТОВКА, СУШКА И ХРАНЕНИЕ ЛРС

Траву пустырника собирают в фазу бутонизации и начала цветения, срезая ножами, серпами верхушки стеблей до 40 см и толщиной не более 0,5 см. Уборку травы с плантаций производят жатками (верхнюю часть – побеги 30-40 см). Скошенную траву подвяливают в поле и перевозят к месту сушки. Перед сушкой траву измельчают.

Сбор листьев вахты проводят после цветения растения в июле – августе. Заготавливают вполне развитые листья с остатком черешка не длиннее 3 см. При сборе сырья нельзя срывать молодые и верхушечные листья, так как они при сушке чернеют (идет ферментативное расщепление гликозидов до агликонов, которые легко полимеризуются в темно-коричневые пигменты с образованием различных промежуточных продуктов).

Сбор сырья золотысячника производят в июле – августе, в период цветения, пока сохраняются прикорневые листья. Срезают надземную часть растения ножом или серпом выше прикорневых листьев.

Корни горечавки заготавливают осенью. После очистки от земли и мелких корней толстые корни режут и сушат.

Надземную часть, корневища и корни пиона уклоняющегося заготавливают во время цветения. Корневища и корни выкапывают лопатой, отряхивают от земли, моют в воде и режут на куски. Надземную часть отделяют от корневищ.

Подземные и надземные части сушат раздельно.

Кору калины заготавливают ранней весной, во время сокодвижения, до распускания почек.

Сушат сырье на чердаках, под навесами, в хорошо проветриваемых помещениях или в сушилках. Например, листья вахты, траву золототысячника сушат при температуре 40-50°С; сырье пустырника, горечавки, пиона - при 50-60°С.

Сырье, содержащее иридоиды, хранят в сухом, хорошо проветриваемом помещении.

96

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Носителем фармакологической активности иридоидов является агликон, который по силе действия превосходит гликозид.

Секоиридоиды (типа генциопикрозида) повышают аппетит, стимулируют пищеварение, повышают секрецию желудочного сока. Благодаря горькому вкусу они раздражают рецепторы языка и рефлекторно действуют на органы пищеварения. Используются при анорексии (потере аппетита).

Но сегодня иридоидные гликозиды привлекают внимание новыми видами фармакологической активности:

•желчегонной активностью (аукубин, гарпагид, ацетилгарпагид, аюгол);

•диуретической (каталпол, каталпозид, аукубин);

•противовоспалительной и болеутолющей (гарпагид);

•седативной и транквилизирующей (валепотриаты);

•противоопухолевой (асперулозид);

•слабительной (генипозид и его агликон генипин);

•гипотензивной, коронарорасширяющей, спазмолитической, гипогликемической и антиаритмической (олеуропеин);

•антибиотической, фунгистатической и ранозаживляющей (аукубин, плюмерицин, генциопикрозид);

•антимикробной (аукубин и его агликон аукубигенин, непетолактон, гениповая кислота);

•антилейкемической (плюмерицин, плюмерид, адамантин).

Таблица 7 Химический состав, фармакологическая активность

и использование ЛРС, содержащего иридоиды.

99

ТЕМА 7. СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ

Сердечными гликозидами называются гликозиды, агликоном которых являются производные циклопентанпергидрофенантрена, содержащие в положении 17 ненасыщенное пятиили шестичленное лактонное кольцо и оказывающие специфическое действие на сердечную мышцу.

В больших дозах они являются сердечными ядами, однако в малых дозах улучшают деятельность сердца. Пока не найдены равноценные синтетические заменители, поэтому растения являются единственным источником получения сердечных гликозидов.

ХАРАКТЕРИСТИКА АГЛИКОНА

В основе строения лежит стероидная структура циклопентанпергидрофенантрена:

Близкая структура лежит в основе желчных кислот, мужских и женских половых гормонов, гормонов коры надпочечников, витаминов группы Д, сапонинов, фитостеринов, холестерина.

В сердечных гликозидах кольца А/В могут иметь как цис-, так и транс-сочленение, а кольца В/С всегда занимают транс-положение. Кольца С/Д в отличие от других природных стероидов имеют циссочленение.

Агликоны имеют ряд общих заместителей:

-в С3 и С14 положениях - гидроксильные группы (-ОН);

-в С13 положении - метильная группа (-СН3).

Кроме того, гидроксильные группы могут находиться в положе-

ниях С5, С12, С16, иногда в С1, С2, С11, С15.

Гидроксил С16 положения в некоторых агликонах может быть ацилирован муравьиной, уксусной или изовалериановой кислотами.

Всегда имеется заместитель - R в С10 положении, в С17 положении находится ненасыщенное лактонное кольцо (5-ти- или 6-тичленное).

Углеводная часть молекулы присоединяется к агликону через атом кислорода (О-гликозиды) в положении С3.

100

Наиболее биологически активны соединения с цис-сочленением колец А/В, С/Д, β-ориентацией лактонного кольца и других функциональных групп (ОН-группа у С3).

Введение ОН-группы в С11, С12 – положения повышает, а в С16- положение снижает активность; ацетилирование этой группы повышает токсичность.

Специфическое кардиотоническое действие сердечных гликозидов обусловлено главным образом агликонами.

СТРОЕНИЕ САХАРНОГО КОМПОНЕНТА

В составе сахарного компонента обнаружены 45 различных моносахаридов. Углеводная часть молекулы содержит от 1 до 5 моносахаридов. Помимо D-глюкозы, D-галактозы, L-рабинозы, и др. моносахаридов присутствуют специфические сахара, обедненные кислородом (так называемые дезоксисахара), например, L-рамноза, D- цимароза, D-дигитоксоза и др:

β-D-ГЛЮКОЗА β-D-ДИГИТОКСОЗА β-D-ЦИМАРОЗА

Как видно из приведенных формул, у дигитоксозы и цимарозы в положении 2 отсутствует оксигруппа. У цимарозы имеется метоксильная группа. Углеводные компоненты построены линейно, к агликону присоединяются сначала дезоксисахара, а остальные моносахариды занимают концевой участок. Углеводная часть может быть ацилирована уксусной кислотой или производными оксикоричной кислоты.

Природа углеводного остатка оказывает влияние на биологическую активность. На скорость и силу кардиотонического эффекта оказывает влияние характер углеводного компонента: наиболее сильное, но кратковременное воздействие вызывают монозиды; с удлинением углеводной цепочки действие становится более мягким и длительным. Сахара смягчают токсические свойства гликозидов, повышают их растворимость, а, следовательно, и более легкое их всасывание.

101

СИСТЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ

1. В зависимости от строения лактонного кольца сердечные гликозиды разделяются на 2 группы:

БУФАДИЕНОЛИД

Специфическое действие на сердечную мышцу обусловлено наличием в молекуле сердечного гликозида ненасыщенного лактонного кольца. Любые изменения в структуре лактонного кольца (расщепление под действием щелочи, окисление, гидрирование) ведут к потере сердечного действия.

2. В зависимости от заместителя в 10 положении карденолиды подразделяются на 3 подгруппы:

1) подгруппа наперстянки имеет в 10 положении метильную

(-СН3) группу:

O O OH

HO

ДИГИТОКСИГЕНИН

102