Цели и задачи постановки биопробы на лабораторных животных

Биопробу на лабораторных животных ставят с целью воспроизведения клиники заболевания, патогенеза, выявления экзотоксинов бактерий, определения типа токсина, получения чистых культур микроорганизмов, определения DLM, LD₅₀, DCL, для испытания новых препаратов, для контроля выпускаемых медицинских препаратов на безвредность, реактогенность и иммуногенность.

Наиболее широко в микробиологической практике используют кроликов, морских свинок, белых мышей, крыс. Лабораторные животные являются донорами, у которых берут кровь для получения сывороток, плазмы, эритроцитов, лейкоцитов, необходимых при постановке многих серологических реакций и для приготовления кровяных питательных сред.

В зависимости от цели исследования пользуются различными методами заражения: внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрибрюшинным, пероральным или интраназальным. При выборе способа заражения следует учитывать, прежде всего, механизм распространения возбудителя инфекции (аэрогенный, фекально-оральный, трансмиссивный, контактный и др.) и тропизм возбудителей.

Внутрикожный способ заражения. При этом способе применяют тонкие (№ 18 - 20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения материала растягивают I и II пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под очень острым углом, почти касаясь кожи. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой, вследствие чего ее сравнивают иногда с лимонной корочкой. Материал вводят в объеме до 0,1 мл обычно в кожу спины или живота.

Подкожный способ заражения. Кожу в месте введения материала берут у ее основания, приподнимают I и II пальцами левой руки. Иглу шприца вкалывают снизу образовавшейся складки. Проколов кожу и пройдя вглубь на несколько миллиметров, иглу отклоняют вправо или влево и затем медленно вводят материал, содержащийся в шприце. Изменять направление иглы под кожей рекомендуется для того, чтобы введенное вещество не выступало через прокол кожи наружу. Затем складку кожи отпускают, на место укола накладывают ватный тампон, смоченный спиртом или спиртовым раствором, а иглу быстро вынимают. Наиболее удобными местами для подкожного введения материала у кроликов и морских свинок являются область спины и боковые поверхности несколько ниже подмышечных впадин, у крыс и мышей - область спины, крестца и затылка. Количество жидкости, вводимой подкожно, не должно превышать 30 мл - для кроликов, 15 мл - для морских свинок, 10 мл - для крыс и 1 мл для мышей.

Внутримышечный способ заражения. Выбирают участок тела с наиболее развитым мышечным слоем. У кроликов и морских свинок, крыс и мышей таким местом является наружная верхняя треть бедра задней лапы. Захватывают I и II пальцами левой руки толстую мышечную складку и вводят иглу почти под прямым углом вглубь мышц. Объем жидкости, допустимый для внутримышечного введения, составляет для кроликов 8 мл, для морских свинок - 5 мл, для крыс 3 мл, для мышей - 0,5 мл.

Внутрибрюшинный способ заражения. Помощник держит животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. У животных (за исключением мышей) в нижней трети живота, несколько отступя от средней линии, делают скальпелем или остроконечными ножницами надсечку кожи длиной 2 -3 мм и через нее вводят притуплённую иглу, держа шприц перпендикулярно к брюшной стенке. Преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу продвигают вглубь. Чувство "провала", исчезновение ощущения сопротивления на пути говорят о проникновении иглы в брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и вводят содержащийся в шприце материал в полость брюшины. Внутрибрюшинно можно вводить до 30 мл жидкости кроликам, до 10 мл морским свинкам, до 5 мл - крысам, до 2 мл - мышам.

Заражение через пищеварительный тракт. Наиболее простым и естественным является способ заражения через пищевые продукты. Инфекционный материал подмешивают к пище или питью животного. Однако этот метод в лабораторной практике нашёл ограниченное применение в связи с трудностью дозирования применяемого препарата. Поэтому для заражения животных чаще используют шприц, игла которого имеет незначительный изгиб и утолщение на конце в виде оливы.

Интраназальное заражение. Животному прикладывают к носу кусочек ваты, смоченной эфиром или хлороформом. К заражению приступают после того, как у животного появится состояние легкого наркоза. Зараженный материал с помощью шприца вводят в нос небольшими каплями на глубину 1-1,5 мм мышам, 2-3 мм крысам, 4 мм кроликам и морским свинкам. Чтобы не поранить слизистые оболочки, для введения материала берут абсолютно тупую иглу. Фиксация мышей

Мышь пускают по столу, придерживая ее I и II пальцами правой руки за кончик хвоста. Когда, продвигаясь в каком - либо направлении, мышь натянет хвост, быстрым движением левой руки хватают ее за складку кожи в области затылка, ближе к ушам, чтобы она не могла поворачивать голову. Подняв мышь над столом, помощник держит ее на весу одной рукой за хвост, другой - за складку кожи на затылке, несколько растягивая в положении, удобном для экспериментатора.

Работать с мышами можно и без помощника, фиксируя их левой рукой: I и II пальцами левой руки животное захватывают за складку кожи в области затылка, а остальными 3 пальцами, прижав их к запястью, придерживают хвост и кожу в области крестца. При таком способе фиксирования правой свободной рукой можно производить различные операции.

Работа № 3. Бактерицидная функция кожи

Цель: зарегистрировать результаты опыта по изучению бактерицидных свойств кожи (см. теоретическую справку)

Методика.

Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50000) наносят на внутреннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпателем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 минут - со смежного. Инкубируют посевы 18-24 часа при 37°С и подсчитывают колонии на 3 см² поверхности каждой пластины.

Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле:

ИБ = К1-К2 х100

К1

где K l - количество колоний сразу после нанесения на кожу тест-штамма микроорганизмоов, К 2 - количество колоний через 15 минут после контакта с кожей.

У здоровых людей ИБ равен 90-100%

Дано:

1) посев-отпечаток с участка кожи с тест-культурой на предметном стекле со средой Эндо.

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) посев-отпечаток со смежного участка кожи через 15 мин после нанесения тест-культуры

Результат:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 4. Бактерицидная активность лизоцима слюны

Цель: определить активность лизоцима слюны (см. теоретическую справку)

Дано: набор для определения активности лизоцима: раствор слюны 1:20, взвесь суточной агаровой культуры микрококка, физиологический раствор, пипетки, пробирки.

Методика:

В пробирки «К» и «О» внести по 0,5 мл физ. раствора и раствора слюны, в каждую пробирку добавить по 0,5 мл взвеси культуры микрококка, встряхнуть; поставить в термостат на 30 мин.

«К» «О»

Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 5. Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК)

Цель: Определить БАСК по отношению к кишечной палочке по методике, предложенной А.Д. Евтушенко с соав., 1982

Методика:

Из 18-ти часовой культуры кишечной палочки методом серийных разведений готовят рабочую концентрацию до 40-50 тыс. м. т. в 1 мл. Рабочую взвесь тест-микробов в количестве 0,1 мл высевают на чашку Петри с МПА. Шаблоном диаметром 20 мм по поверхности агара с культурой микроорганизмов делают отверстия (в центре и по периферии отмечают контрольные отверстия, на которые не наносится испытуемая сыворотка). На каждую площадку с посевом тест-культуры наносят пипеткой 0,05 мл исследуемой сыворотки. Через 24 часа инкубации в условиях термостата проводят подсчет выросших колоний, как на опытных, так и на контрольных площадках. Бактерицидную активность сыворотки крови рассчитывают по формуле:

БАСК(%) =100 х (1 - конечное количество жизнеспособных бактерий)

исходное количество бактерий

Нормативное значение - 80 - 90%

Дано: опыт по определению БАСК у четырех пациентов (см. теоретическую справку)

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа № 6. Фагоцитоз

Цель: Микроскопировать готовые препараты-мазки стафилококка и гонококка. Зарисовать в тетради картину фагоцитоза микроорганизмов. Выявить отличительные особенности завершенного (№ 1) и незавершенного (№ 2) фагоцитоза в препаратах-мазках. Сделать вывод.

Методы оценки функциональной активности фагоцитирующих клеток

Одной из основных функций гранулоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов) и моноцитов крови является эндоцитоз - захват различных объектов: инертных частиц (латекс, уголь), живых или убитых микроорганизмов (бактерии, дрожжеподобные грибы). Количественную оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов проводят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром от 1,0 до 2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием клеток бактерий или дрожжеподобных грибов.

Показателями клеточных факторов неспецифической защиты организма являются: активность фагоцитоза (АФ) и фагоцитарный показатель (ФП).

Определение:

- обнаруживают под микроскопом 10-20 лейкоцитов, передвигая предметное стекло так, чтобы под объективом находился край препарата из исследуемой крови;

- подсчитывают число микробов, захваченных каждым обнаруженным лейкоцитом.

ФП - среднее число микробов в одном лейкоците. Норма 4,2.

АФ - процент лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе. Норма 60%.

Дано: препараты-мазки, таблицы

Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Вывод:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

Самостоятельная работа во внеурочное время

Схема классификации препаратов:

1. Название

2. Классификационное положение

3. Действующее начало, механизм действия

4. Получение

5. Применение

6. Способ применения