4.2. Умови проведення трансфекцій
Щоб перевірити чи взаємодіють між собою NPRL2 та обрані компоненти комплексу MARS було проведено трансфекцію 0,5 млн клітин людини на чашках площею 56,7 см2. Для цього використали таку загальну кількість ДНК, як 2 мкг на кожну чашку. Трансфекцію проводили для отримання трьох зразків:
позитивний контроль — pc5FLAG/TUSC4:pSG5 зі співвідношенням 1:2;
зразок для перевірки — pc5FLAG/TUSC4:pCMV6-XL5/ARS зі співвідношенням 1:2;
негативний контроль — pc5FLAG:pCMV6-XL5/ARS зі співвідношенням 1:2.
Позитивний контроль використовувався для перевірки експресії плазмідного вектору, що кодує NPRL2 та взаємодії білка із ендогенними компонентами MARS. Плазмідна ДНК pSG5 не кодувала жодного білка інтересу, але використовувалась для стандартизації умов трансфекції, адже у такому випадку кожен зразок містив однакову кількість плазмід. У тотальному екстракті білків зразку для перевірки очікувалось отримати білок NPRL2 та певну кількість екзогенної АРСази, а у фракції після імунохроматографії - NPRL2, що містить мітку Flag та, в разі взаємодії, певну кількість аміноацил-тРНК-синтетази. Щоб упевнитись, що фермент взаємодіє саме із екзогенним білком NPRL2, а не з афінним матриксом, було створено негативний контроль: в результаті котрансфекції отримували Flag-пептид та певну АРСазу, яка не преципітувалась на даному типі матриксу.
Так, як у клітинах є неможливим усунення ендогенних аміноацил-тРНК-синтетаз, які є необхідними для біосинтезу білків, було використано екстракт нетрансфікованих клітин для контролю кількості їх власного ферменту.
Для оптимізації кількості білка, який буде аналізуватись методом Вестерн-блотинга, його попередньо наносили на гель та аналізували за допомогою системи візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad) по 15 мкл фракції розчинних білків та фракції, яка не зв’язалась із афінним матриксом. Кількість білків порівнювалась відповідно до інтенсивності флуорисценції триптофану з використанням програмного забезпечення Image Lab. Після цього підбиралися оптимальні об’єми зразків так, щоб вони містили однакову кількість білків. Всередньому ця кількість складала 5 мкл чистого екстракту у буфері для нанесення. Після проведення електрофорезу для Вестерн-блот аналізу кількість білків знову перевірялась за допомогою тієї ж системи. Елюцію проводили у 50 мкл буферу WB50+. З них 11,25 мкл елюату використовували для перевірки наявності аміноацил-тРНК-синтетаз, а 3 мкл - для перевірки NPRL2.
4.3. Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
При трансфекції культури клітин HeLa плазмідними векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/MRS ми спостерігали помірну експресію екзогенного генетичного матеріалу (Рис. 4.3). Про це свідчить збільшення кількості метіоніл-тРНК-синтетази у загальному екстракті білків після котрансфекції (Рис. 4.3, доріжка 6) по відношенню до кількості ендогенного ферменту (Рис. 4.3, доріжка 5). Також цікавий той факт, що кількість ендогенної синтетази зменшувалась при контрансфекції клітин векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5 (Рис. 4.3, доріжка 5) по відношенню до її кількості у нетрансфікованих клітинах (Рис. 4.3, доріжка 1).
При аналізі фракцій, які зв’язались із афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, на блотограмі детектовано певну кількість MRS, яка, ймовірно, взаємодіє із NPRL2. Проте наявність однакової кількості білка у фракціях, що не містили екзогенної MRS (Рис. 4.3, доріжка 8) чи NPRL2 з міткою Flag (Рис. 4.3, доріжка 10), свідчить про неспецифічну взаємодію ферменту із афінним матриксом.
Інтенсивніший сигнал, який спостерігається при аналізі фракції, яка була отримана після імунохроматографії клітин, котрансфікованих плазмідами, що містили відкриті рамки зчитування NPRL2 з міткою Flag та MRS (Рис. 4.3, доріжка 9), пояснюється більшою кількістю ферменту, отриманого при котрансфекції (Рис. 4.3, доріжка 6).
Отже, наявність метіоніл-тРНК-синтетази у фракціях, одержаних після очистки загального екстракту білків на афінному матриксі Affinity gel Anti-Flag M2 швидше за все свідчить про можливу неспецифічну взаємодію ферменту з матриксом, але не з білком NPRL2.
Рис. 4.3. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл(А) та IgG MTS-T 14/04/85 антитіл (Б)
Доріжки: 1 — загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;