- •Київський національний університет імені тараса шевченка
- •Оцінка взаємодії білка nprl2 з компонентами мультиферментного комплексу аміноацил-тРнк-синтетаз
- •Реферат
- •Перелік умовних скорочень
- •Огляд літератури розділ 1 Білок nprl2 та його біологічна роль
- •1.1. Ідентифікація гену tusc4
- •1.2. Білок nprl2 як продукт гену tusc4
- •1.3. Білок nprl2 у mTor-сигнальному шляху
- •Розділ 2 Мультиферментні комплекси аміноацил-тРнк-синтетаз
- •2.1. Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот
- •2.2. Неканонічні функції аміноацил-тРнк-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу mars
- •Експериментальна частина розділ 3 матеріали і методи досліджень
- •3.1. Матеріали та реактиви
- •3.2. Клітинна лінія
- •3.3. Підготовка днк для трансфекції
- •3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції
- •3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції
- •3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent
- •3.7. Імунохроматографія з використанням матриксу, що містив іммобілізовані антитіла до мітки Flag
- •3.8. Вестерн-блот аналіз
- •3.9. Візуалізація результатів досліду
- •Результати та їх обговорення
- •4.1. Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene
- •4.2. Умови проведення трансфекцій
- •4.3. Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/mrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/mrs.
- •4.4. Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/qrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/qrs.
- •4.5. Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/drs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/drs.
- •4.6. Ідентифікація взаємодії між лізил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/krs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/krs.
- •4.7. Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу mars, та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/р43;
- •Висновки
- •Список використаної літератури
3.3. Підготовка днк для трансфекції
Бактеріальні колонії, які містили рекомбінантні плазміди на основі вектору pCMV6-XL5 було ізольовано та висіяно у 150 мл рідкого поживного середовища з додаванням ампіциліну. Культури інкубували при 370С протягом 16 годин до досягнення культурою щільності 0,35-0,4 OD.
Для отримання плазмідної ДНК використовували набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN). Процедуру виконували згідно протоколу. По закінченню вимірювали концентрацію отриманого матеріалу методом спектрофотометрії та зберігали його при -200С.
3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції
Культуру клітин HeLa вирощували у матрацах для культивування площею 75 см2 з додаванням збагаченого середовища DMEM до досягнення конфлюентності 80%. Після чого вживане середовище відбирали, додавали 2 мл хелатуючого реагенту Versene та інкубували 20-30 сек для відокремлення адгезованих клітин від поверхні. Відокремлені клітини суспензували з додаванням 8 мл нового середовища.
Для підрахунку кількості клітин використовували ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore). Підрахунок проводили згідно інструкції до приладу. Відому кількість клітин розводили у збагаченому середовищі DMEM до концентрації 0,25*106 клітин/мл.
Для трансфекції використовували 0,5*106 клітин, які висівали у 10 мл поживного середовища у пластикових чашках Петрі (діаметр 8 см, площа поверхні 56,7 см2). Культури вирощували 24 години в умовах 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С.
За дві години до трансфекції середовище у чашках з культурами замінювали свіжим.
3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції
Оптимальну кількість клітин та умови для експерименту було підібрано експериментальним шляхом.
Для отримання оптимальних умов трансфекції було використано плазмідні ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6, які кодують білки NPRL2 з міткою Flag та глутаміл-проліл-тРНК-синтетазу відповідно. Загальну кількість ДНК, 0,35 мкг, було вирахувано теоретично, відповідно до попередніх експериментів. У пластикових чашках Петрі (діаметр 35 мм, площа - 9,6 см2) протягом 24 годин вирощувалась культура клітин у кількості 0,2 млн клітин на чашку на момент посіву. Для трансфекції використовували набір Effectene Transfection Reagent. За інструкцією до набору було протестовано такі умови:
відношення між плазмідними ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6 — 1:1, кількість реагенту для транфекції Effectene — 25 мкл/1 мкг ДНК;
відношення між плазмідними ДНК — 1:1, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК;
відношення між плазмідними ДНК — 1:1, кількість реагенту для транфекції — 6,75 мкл/1 мкг ДНК;
відношення між плазмідними ДНК — 1:2, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК;
відношення між плазмідними ДНК — 1:3, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК.
3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent
Для трансфекції використовували 0,5 млн клітин при посіві на чашку Петрі діаметром 85мм (площа 56,7 см2), які культивувались 24 години в умовах 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С. Загальна кількість ДНК складала 2 мкг.
Процес трансфекції проводили відповідно інструкції до набору Effectene Transfection Reagent. У 500 мкл буферу додавали 2 мкг ДНК у кількісному співвідношенні 1:2 та обережно перемішували. Потім додавали 16 мкл підсилювача (Enhancer) у співвідношенні 8 мкл підсилювача на 1 мкг ДНК, обережно перемішували та інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Effectene додавали у кількості 13,5 мкл, тобто у співвідношенні 6,75 мкл на 1 мкг ДНК, перемішували піпетуванням та інкубували 10 хв за кімнатної температури. До культури суміш додавали по краплинах, рівномірно розподіляючи по всій площині.
Трансфіковані культури вирощували за умов 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С протягом 48 годин.