БХ-методичка

Тема 2. Исследование биосинтеза и катаболизма пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Определение конечных продуктов их обмена.

Актуальность темы.

Структурными компонентами ДНК и РНК является пуриновые та пиримидиновые мононуклеотиды. Их биосинтез обеспечивает образование информационных молекул нуклеиновых кислот, необходимых для реализации генетической информации.

Распад нуклеиновых кислот в тканях сопровождается образованием конечных продуктов. Характерным продуктом распада пуриновых нуклеотидов является мочевая кислота, избыточное образование которой способствует развитию подагры.

Подагра может быть следствием недостаточной азотвыделительной функции почек, заболевания сердца, наследственных нарушений обмена пуринових нуклеотидов, а также избыточного употребления продуктов, богатых на нуклеопротеиды.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Знать биохимическую динамику превращения нуклеотидов, основы их патохимии и биохимической диагностики.

Конкретные цели:

1.Анализировать последовательность реакций биосинтеза и катаболизма пиримидиновых нуклеотидов.

2.Анализировать последовательность реакций биосинтеза и катаболизма пуриновых нуклеотидов, нарушение синтеза мочевой кислоты и биохимические

основы развития подагры. Исходный уровень знаний-умений.

1.Уметь проводить титрование (общая химия).

2.Уметь писать строение азотистых оснований и мононуклеотидов.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

61

Индивидуальная самостоятельная работа студента.

Подготовить реферат на тему: «Подагра, возможные причины и клинические проявления».

Алгоритм лабораторной работы.

Количественное определение мочевой кислоты в сыворотке крови.

Принцип метода. Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив до образования голубого цвета, которой в щелочной среде с обесцвечением количественно реагирует с K3[Fe(CN)6]. Сравнивают результаты опытной и стандартной проб.

Ход определения. Используют две колбочки для опытной (О) и стандартной (С) проб.

1)В колбу (С) вносят 2 мл стандартного раствора мочевой кислоты (0,5 мг/мл, то есть в пробе 1 мг мочевой кислоты), в колбу (О) вносят 2 мл мочи. В обе колбы добавляют по 1 мл раствора NaOH и 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива. Перемешивают, появляется синяя окраска.

2)Содержание колб титруют до обесцвечения раствором K3[Fe(CN)6] и отмечают количество раствора, которое израсходовано на титрование опытной и стандартной проб.

3)Расчет ведется по пропорции. Допустим, что на титрование пробы (С) пошло

смл раствора K3[Fe(CN)6], а на пробу (Д) - d мл. С учетом суточной экскреции мочи 1,5 л проводят расчет:

dc 0,75= г/сутки

Норма выделения с мочой мочевой кислоты: 0,25 - 0,75 г/сутки

Тема 3. Исследование репликации ДНК и транскрипции РНК.

Актуальность темы.

Генетическая информация, которая содержится в ДНК хромосомах, может быть реализована путем репликации, или с помощью рекомбинации, транспозиции и конверсии. Эти процессы являются основой изменчивости организмов, которые обусловливают их способность к адаптации, но они могут быть причиной развития патологических состояний. Изменения транскрипции ДНК отображается на уровне биосинтеза белка и приводит к разным метаболическим нарушениям в клетке. Знания механизмов репликации и транскрипции позволяет ответить на вопрос, что такое нормальная физиология и патофизиология заболеваний на молекулярном уровне.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Выучить биохимические механизмы репликации ДНК и транскрипции РНК.

Конкретные цели:

62

3.Трактовать молекулярно-биологические закономерности сохранения и передачи генетической информации, роль ферментных систем, которые обеспечивают полуконсервативный механизм репликации ДНК у прокариотов и эукариотов.

4.Объяснять механизмы функционирования ферментной системы транскрипции РНК.

5.Анализировать последовательность этапов репликации ДНК и транскрипции РНК.

Исходный уровень знаний-умений: знать химическую структуру ДНК и РНК.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Индивидуальная самостоятельная работа по выбору.

1.Подготовить реферат на темы: «Антибиотики – ингибиторы транскрипции», «Сущность открытия Дж. Уотсона и Фр. Крика (1953)».

2.Создать схему репликации ДНК.

3.Создать схему транскрипции РНК.

Тема 4. Биосинтез белка на рибосомах. Исследование процессов инициации, элонгации и терминации в синтезе полипептидной цепи. Ингибиторное действие антибиотиков.

Актуальность темы.

63

Раскрытие механизмов синтеза белка и природы наследственных заболеваний базируется на знании генетического кода, который образует набор кодонов. Биосинтез аномальных белков лежит в основе наследственных заболеваний, обусловленных мутациями – изменениями в нуклеотидной последовательности гена. Антибактериальное действие антибиотиков базируется на их способности взаимодействовать с белками рибосом прокариотов и ингибировать синтез бактериальных белков. Знания молекулярных основ биосинтеза белка крайне необходимы для объяснения процессов регенерации заживления ран и пути их коррекции, а также для анализа патологических процессов, основу которых составляет нарушение анаболизма и катаболизма (белковая недостаточность, гипотрофия у детей, истощение, дисфункция эндокринных желез, голодание и др.).

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Выучить молекулярную организацию клеток, генетического аппарата, системы белкового синтеза для раскрытия природы наследственных заболеваний и методов их профилактики и коррекции.

Конкретные цели:

1.Объяснять механизмы функционирования ферментативной системы транскрипции РНК.

2.Трактовать понятие белоксинтезирующей системы клетки.

3.Объяснять механизмы функционирования белоксинтезующей системы при участии ферментов активации аминокислот, инициации, элонгации и терминации

биосинтеза полипептидных цепей.

Исходный уровень знаний: основы генетики из курса биологии.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

64

Практические навыки.

1.Объяснить противоопухолевое действие антибиотиков-ингибиторов инициации: стрептомицина, рифамицина, рифампицина.

2.Объяснить механизм действия антибиотиков-ингибиторов элонгации: амицетина, хлорамфеникола, эритромицина, циклогексимида, пуромицина, тетрациклинов.

3.Объяснить механизм действия антибиотиков-ингибиторов терминации: анизомицина, хлорамфеникола, эритромицина, линкомицина, стрептомицина.

4.Объяснить механизм действия интерферонов.

5.Объяснить механизм действия дифтерийного токсина.

6.Объяснить молекулярные механизмы мутации. Какие наиболее распространенные мутагены вы знаете?

Индивидуальная самостоятельная работа по выбору.

1.Создать схемы: репликации и транскрипции; регуляции экспрессии генов; репарации ДНК; механизм действия белково-пептидных и стероидных гормонов на клетки-мишени.

2.Нарисовать схемы последовательных этапов процессов репликации, транскрипции и трансляции.

Тема 5. Регуляция экспрессии генов.

Актуальность темы.

Регуляция экспрессии генов является одним из фундаментальных механизмов адаптации живых организмов к изменениям окружающей среды. Учитывая принципиально разную степень сложности и молекулярной организации генома у безъядерных прокариотов и высших ядерных организмов – эукариотов, механизмы экспрессии генов у них значительно отличаются.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Знать механизмы регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции оперонов. Уметь трактовать биохимические механизмы генетических рекомбинаций, амплификаций генов, особенности регуляции экспрессии генов у эукариотов.

Конкретные цели:

1.Трактовать механизмы регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции оперонов, которые включают структурные и регуляторные гены, промотор и оператор.

2.Трактовать биохимические механизмы генетических рекомбинаций, амплификации генов, особенности регуляции экспрессии генов у эукариотов.

65

Исходный уровень знаний-умений: знать строение и функции нуклеиновых кислот. Уметь писать формулы азотистых оснований, пентоз, мононуклеотидов. Знать этапы репликации, транскрипции и трансляции.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Индивидуальная самостоятельная работа по выбору.

Сделать реферативное сообщение на тему: ”Наследственные молекулярные болезни, механизмы их возникновения”.

Принципы проведения ДНК-тестирования (теоретически).

Особенное место в клинической генетике занимает ДНК-тестирование (так называемая ДНК-зондовая диагностика). Сегодня только она с абсолютной точностью дает возможность исследовать и установить причину заболевания любого

66

происхождения. ДНК-тестирование проводят с помощью молекулярного зонда, благодаря которому можно распознать нуклеотидную последовательность ДНКизмененной хромосомы.

Для этого выделяют незначительное количество хромосомной ДНК лимфоцита, разрезают ее рестриктазами на фрагменты, определяют у них последовательность нуклеотидов, а затем проводят гибридизацию этих фрагментов с меченой ДНК, определяют среди них гомологичные, проводят электрофорез и за отклонением гибридологических полос выявляют дефекты в ДНК-молекулах. Эти исследования нужно проводить в семьях, где есть заболевание с поздним выявлением патологического гена.

Благодаря введению ДНК-тестирования удалось сделать ряд существенных выводов:

1.Гены, которые кодируют белки с похожими функциями, могут находится в разных хромосомах (α и β-глобины).

2.Гены, которые относятся к одному семейству, также могут локализоваться в разных хромосомах (гормон роста и пролактин).

3.Гены, которые детерминируют большинство наследственных патологий, вызванных недостаточностью специфических белков (в том числе сцепленных с Х- хромосомой), действительно четко локализованные в определенных сайтах хромосом.

Спомощью ДНК-диагностики можно проводить эффективную пресимптоматическую и пренатальную, и даже преимплантационную диагностику некоторых мультифакториальных болезней уже в І триместре беременности. Это касается фенилкетонурии (хромосома 12), α- и β-талассемии (хромосома 16 и 11 соответственно), муковисцидоза (хромосома 7), миодистрофии Дюшена-Беккера (Х- хромосома), хореи Гентингтона (хромосома 4), синдрома Леша-Найхана (Х- хромосома), гемофилии А и В и др.

Спомощью ДНК-диагностики можно выявить гетерозиготное носительство патологического гена в тех случаях, когда другие методы оказываются неэффективными, а также этим методом можно получить генетический паспорт каждого индивидуума.

Тема 6. Анализ механизмов мутаций, репараций ДНК. Усвоения принципов получения рекомбинантных ДНК, трансгенных белков.

Актуальность темы.

Химические мутагены (аналоги азотистых оснований, дезаминирующие, алкилирующие агенты) и физические (ультрафиолетовое и ионизирующее излучение) вызывают повреждение ДНК, мутации, что является причиной энзимопатий и наследственных заболеваний человека.

Восстановление поврежденных молекул ДНК осуществляется благодаря репарационным системам.

Трансплантация генов, полученных гибридных молекул ДНК, клонирование генов используется с целью получения биотехнологических лекарственных средств и диагностикумов (гормонов, ферментов, антибиотиков, интерферонов и др.).

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Уметь применять знание о механизмах мутаций и репараций для объяснения причин и последствий наследственных заболеваний, обоснование принципов

67

получения рекомбинантных ДНК, трансгенных белков, биотехнологических лекарственных средств.

Конкретные цели:

1.Трактовать биохимические механизмы генетических рекомбинаций, амплификации генов.

2.Анализировать последствия геномных, хромосомных и генных мутаций, механизмы действия наиболее распространенных мутагенов, биологическое значение и механизмы репарации ДНК (репарация УФ-индуцированных генных мутаций).

3.Объяснять биохимические и молекулярно-биологические принципы методов генной инженерии, технологий рекомбинантных ДНК, трансплантации генов и получения гибридных молекул ДНК.

4.Объяснять принцип клонирования генов с целью получения биотехнологических лекарственных средств.

Исходный уровень знаний-умений: знать структуру нуклеиновых кислот, мононуклеотидов, азотистых оснований, пентоз.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Задание для самостоятельной работы студентов.

1.Оценивать врожденные пороки метаболизма (молекулярные болезни) как следствие генетических повреждений и точечных мутаций.

2.Создать схему репарации ДНК.

68

Индивидуальная самостоятельная работа студентов по выбору.

Подготовить реферативное сообщение по темам:

1.Анализ современных методов определения гормонов в биологических жидкостях. Биохимическая диагностика функций гипоталамуса и гипофиза.

2.Роль гормонов гипоталамуса, гипофиза в развитии стресс-синдрома.

Тема 8. Исследование молекулярно-клеточных механизмов действия стероидных гормонов на клетки-мишени. Стероидные гормоны.

Актуальность темы.

70