Частная_ISBN-NEW

Подготовка материала. Из патологического материала готовят 20%-ную суспензию (1:5) на растворе Хенкса или изотоническом растворе натрия хлорида. После этого ее центрифугируют при 1500-2000 об/мин. К надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл, выдерживают в течение 3-8 часов при 2- 4˚С и используют для заражения биологических тест-объектов. Материал, присланный для гистологического исследования, отмывают от формалина, делают мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы. Сыворотки, присланные для серологического исследования, инактивируют при 56˚С в течение 30 минут.

Лабораторную диагностику инфекционного ларинготрахеита проводят по следующим направлениям:

-обнаружение специфических телец-включений в патматериале гистологическим методом или вирусного антигена в соскобах из трахеи с последующим выделением вируса и ее идентификацией;

-выявление прироста антител в сыворотке крови больной или переболевшей птицы (ретроспективная серодиагностика).

Обнаружение специфических телец-включений при инфекцион-

ном ларинготрахеите имеет диагностическое значение из-за характерной морфологии. Для этого фиксированные в абсолютном метиловом спирте мазки со слизистых оболочек окрашивают краской Гимза (1 капля на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 часов при 37˚С, затем мазки промывают, снова обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, высушивают

иисследуют под микроскопом.

Вположительных случаях обнаруживают внутриядерные включения светло-красного цвета на фоне бледно-голубой цитоплазмы клеток с более темным ядром. Специфические внутриядерные включения могут быть шарообразные, продолговатые, иногда в форме диплококков; занимают половину или треть ядра, окружены ясно видимым светлым ободком (характерный признак). Количество их в ядре может быть от одного до четырех. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутриядерных включений Зейфрида.

Первичное обнаружение вируса в патматериале можно прово-

дить при помощи РИФ прямым методом с исследованием мазков со слизистых оболочек трахеи и конъюнктивы. Обычно положительный результат иммунофлуоресценции совпадает с обнаружением внутриядерных включений. С этой целью могут быть использованы ИФА и РИД

Выделение вируса осуществляют на РКЭ, реже – культурах клеток. Приготовленной 20%-ной суспензией заражают 10 эмбрионов 9-12- дневного возраста на ХАО. Гибель в первые 24 часа считают неспецифической. Оставшихся живых эмбрионов убивают на 6-8-й день и вскрывают. Штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита вызывают локальные поражения хорион-аллантоисной оболочки в виде очаговых поражений на месте инокуляции вируса и появления по всей поверхности оболочки узелковых поражений. Считается, что крупноузелковые поражения

48

того, выделяют дифтеритическую форму с фибринозным поражением слизистой оболочки носовой и ротовой полостей.

Возбудителями оспы животных являются вирусы из семейства

Poxviridae, подсемейства Chordopoxvirinae различных родов: Orthopoxvirus – воз-

будители оспы у коров, человека, лошадей, кроликов и др., Avipoxvirus – птиц

(прежде всего кур), Capripoxvirus – овец и коз, Suipoxvirus – свиней, Leporipoxvirus – вирусы миксомы и фибромы кроликов, Parapoxvirus – параоспенные вирусы. Вирусы различных родов отличаются по биологическим свойствам, главным из которых является спектр патогенности – первый из названных считается полиэтиологическим, то есть способным вызывать оспу у широкого спектра хозяев.

Все оспенные вирусы являются ДНК-геномными и содержат в составе вириона фермент для собственной транскрипции. В этой связи все вирусы данного семейства, не нуждаясь в клеточных ферментах транскрипции, реплицируются в цитоплазме клеток. Другими отличительными особенностями вирусов оспы является их большой размер, сопоставимый с размерами мельчайших бактерий, и они могут быть обнаружены световой вирусоскопией. Для вирусов оспы характерно наличие сложного типа симметрии, который обусловлен присутствием двух дополнительных структур, входящих в состав вириона. Они представляют собой мембраны, наружная из которых большей толщины и имеющая большое количество полых винтообразных филаментов. Нуклеоид в центре вириона имеет характерную двояковогнутую форму. Все вышеотмеченные особенности строения придают зрелому вириону оспы характерную кирпичеобразную форму (обнаруживается в электронном микроскопе).

Вирусы млекопитающих довольно сложно культивировать в лабораторных условиях: на ХАО развивающихся куриных эмбрионов они с трудом культивируются после предварительной адаптации с образованием характерных оспин, способны репродуцироваться в культурах клеток почек и тестикул эмбриона. Лучшим объектом для культивирования вирусов оспы млекопитающих являются естественно восприимчивые животные.

В антигенном отношении различные вирусы оспы млекопитающих идентичны в пределах родов. В основном вирусы оспы млекопитающих гемагглютинирующими свойствами не обладают; вирусы оспы птиц способны агглютинировать эритроциты кур отдельных пород, однако РТГА и РГА в практике используют очень редко.

Диагноз на оспу ставят клиническим методом, однако для его подтверждения проводят лабораторное исследование.

Отбор патматериала. Для исследования берут содержимое везикул и пустул, поверхность которых предварительно очищают ватным тампоном, смоченным в эфире или спирте. Прокол и отбор везикулярной жидкости проводят с помощью пастеровской пипетки, после чего конец ее запаивают. Папулы соскабливают скальпелем. Патологический материал должен быть доставлен в лабораторию в замороженном или охлажденном (4-6ºС) виде. Также его допускается консервировать в 10%-ном растворе глицерина.

Одновременно с отбором патматериала на месте готовят мазки из вези-

21

кулярной и пустулезной жидкости для последующего вирусоскопического исследования. Для этого поверхности везикул или пустул осторожно срезают бритвой и внутренней поверхностью среза однократным движением проводят по предметному стеклу. После приготовления мазки высушивают на воздухе.

Также отбирают материал из измененных участков кожи на границе с неизмененной для гистологического исследования, который помещают в 10%-ный раствор формалина.

Подготовка материала заключается в получении суспензии для заражения животных. Готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе, после чего ее центрифугируют при 2 тыс об/мин в течение 15 мин. Затем к надосадочной жидкости добавляют 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина, 50 ЕД/мл нистатина и выдерживают 12 часов при

4ºС.

Лабораторная диагностика оспы заключается в:

-обнаружении возбудителя в мазках методом световой микроскопии;

-постановке биопробы на животных (в случае получения отри-

цательного или сомнительного результата первого метода).

Обнаружение вируса в патматериале осуществляют методом све-

товой вирусоскопии препаратов-отпечатков, окрашенных по Морозову. В положительном случае в мазках из пораженных участков кожи обнаруживают характерно расположенные вирионов в виде россыпи.

Одновременно с обнаружением элементарных телец параллельно проводят гистологическое исследование материала из пораженных участков. При этом обнаруживают цитоплазматические оксифильные (оспа овец и коз) или ацидофильные (оспа свиней) включения, внутриядерные вакуоли, гиперплазию эпидермиса кожи.

Положительный результат вирусоскопического исследования дает основание на постановку окончательного диагноза на оспу. При получении сомнительного или отрицательного результатов вирусоскопии проводят постановку биопробы на естественно восприимчивых животных.

Биопроба в диагностике оспы млекопитающих заключается в заражении естественно восприимчивых животных, причем выбор объекта заражения зависит от вида животных, у которых диагностируют болезнь. В качестве тестобъекта для постановки биопробы используют молодых неиммунных овец и коз, поросят 2-3- месячного возраст или кроликов. Экспериментальных животных заражают внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста в дозе 0,1-0,15 мл (овцы, козы) или путем скарификации надосадочной жидкостью в объеме 0,6 мл в кожу живота (свиньи) или на поверхность роговицы глаза (кролик). Биопробу считают положительной в случае развития на месте введения местного оспенного процесса через 6-8 дней. Специфичность патологического процесса в ходе постановки биопробы подтверждают вирусоскопическим исследованием мазков, приготовленных из срезанного оспенного узелка.

22

торых заражают в аллантоисную полость смесями различных разведений вируса (от 10-1 до 10-9) с постоянной дозой иммунной сыворотки. Результат реакции оценивают по индексу нейтрализации, который при значении в 2 lg и более указывает на положительную идентификацию вируса болезни инфекционного бурсита. Идентификацию вируса также возможно проводить в РИД в 1%-ном агаровом геле на предметных стеклах или чашках Петри, ИФА и ПЦР.

Серодиагностика инфекционного бурсита заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови в РН, РИД и твердофазном варианте ИФА. В связи с быстрым распространением инфекции среди поголовья птиц обнаружение антител у небольшого числа их позволяет считать все поголовье инфицированным.

Инфекционный ларинготрахеит - вирусная контагиозная болезнь, поражающая главным образом кур и фазанов всех возрастов, а также индеек. Заболевание характеризуется катаральным или фибринозным воспалением слизистых оболочек, и по локализации различают ларинготрахеитную и конъюнктивальную формы. В ряде случаев в патологический процесс могут вовлекаться легкие с развитием катаральной пневмонии. Возбудителем инфекционного ларинготрахеита птиц является вирус из семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesvirinae безымянного рода. Как и все герпесвирусы, вирус инфекционного ларинготрахеита птиц формирует в чувствительных клетках внутриядерные включения, обнаружение которых из-за характерной морфологии имеет диагностическое значение.

Хотя штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, изолируемых от кур на территории СНГ, отличаются по вирулентным и иммунологическим свойствам, антигенных различий у возбудителя не выявлено. В природе установлена циркуляция природоослабленных штаммов, некоторые из которых используют для иммунизации птиц.

Возбудитель инфекционного ларинготрахеита птиц способен длительно персистировать в организме животного, поэтому у птиц-реконвалесцентов установлено носительство длительностью до 2 лет.

Отбор патматериала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, от павших или вынужденно убитых в начальный период болезни (между 2-7 днями) – слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Материал помещают в термос со льдом и направляют в лабораторию.

Для серологического исследования берут кровь на 14-й и 28-й дни после появления болезни не менее чем от 5-10 птиц (по 5 мл крови от каждой птицы). Сыворотку из крови получают общепринятыми методами. До исследования пробы сыворотки сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70˚С.

Для гистологического исследования направляют пробы тех же органов, помещенные в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Необходимо помнить, что выявление специфических внутриядерных включений при инфекционном ларинготрахеите является возможным только в случае гистологического исследования материала, отобранного до наступления некроза в тканях (до 5-го дня после заражения).

47

печень, селезенку и почки, которые отправляют в лабораторию в замороженном виде в термосе со льдом. Для серологического исследования отбирают пробы сывороток крови от больной и переболевшей птицы.

Подготовка материала заключается в приготовлении 10%-ной суспензии на изотоническом растворе натрия хлорида с последующим центрифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают по 1000 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина при 4ºС в течение 6-12 часов и используют для выделения вируса на РКЭ или чувствительной птице. Сыворотку крови инактивируют при 58ºС в течение 30 минут. Из тканей фабрициевой бурсы готовят не менее трех тонких препа- ратов-отпечатков, высушивают, фиксируют 10-20 минут в ацетоне и исследуют в РИФ после промывания в двух сменах фосфатно-буферного раствора.

Лабораторная диагностика инфекционного бурсита проводится по двум направлениям:

-первичное обнаружение вируса в патматериале ;

-выделение вируса и его идентификация;

-обнаружение специфических антител в сыворотке крови боль-

ной и переболевшей птицы.

Первичное обнаружение вируса проводят реакцией иммунофлуо-

ресценции при исследовании препаратов-отпечатков из тканей фабрициевой бурсы. Предварительный диагноз считают установленным в случае обнаружения во всех препаратах не менее 2-3 инфицированных клеток со специфическим ярко-зеленым свечением цитоплазмы (в виде мелких гранул или диффузного ореола вокруг ядра) при отсутствии ядерного свечения.

Выделение вируса проводят путем заражения не менее десяти 10-11- дневных развивающихся куриных эмбрионов из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням. Куриные эмбрионы заражают на хорионаллантоисную оболочку и инкубируют в течение 10 суток. Погибшие эмбрионы вскрывают в день гибели, оставшиеся – на десятые сутки. Вирус инфекционного бурсита вызывает гибель эмбрионов на 3-7-е сутки после заражения, при этом отмечают гиперемию и кровоизлияния в ранние сроки гибели эмбрионов, а после 4-5-го дня – отечность брюшной полости, некрозы и кровоизлияния в печени, селезенке и почках. Хорион-аллантоисная оболочка при этом утолщена и отмечают ее помутнение.

Для выделения также возможно использование 24-48-часовых культур фибробластов куриных эмбрионов или 21-25-дневных цыплят. Цитопатическое действие вируса на культуре клеток характеризуется образованием через 34-72 часа пустот, вакуолизацией и округлением клеток с дальнейшим образованием клеточных конгломератов.

Изолированный на РКЭ и культурах клеток вирус исследуют на отсутствие гемагглютинации с целью дифференциации от патогенных гемагглютинирующих вирусов птиц. Отсутствие гемагглютинации позволяет предположить наличие вируса инфекционного бурсита в материале.

Идентификацию вируса проводят в РН на куриных эмбрионах, ко-

46

Кроме вирусоскопического метода в практике рекомендовано использование РИД для обнаружения вирусного антигена в патматериале.

Серодиагностику и ретроспективную диагностику оспы проводят

редко.

Лабораторная диагностика оспы птиц. Для исследования в лабораторию направляют свежие оспенные поражения с лицевой части головы (гребень, бородки, сережки) или свежие дифтеритические поражения гортани и трахеи. Одновременно с отбором патматериала для вирусологического исследования готовят мазки из пораженных участков для вирусоскопического исследования. Фиксацию мазков проводят на месте, помещая их в смесь спирта и эфира на 3 мин.

Лабораторная диагностика оспы птиц включает:

-обнаружение вирионов в мазках из патматериала;

-выделение вируса на РКЭ и курах с последующей его идентификацией;

-выявление специфических антител в крови переболевшей птицы. Обнаружение вирионов оспы птиц (элементарные тельца Борреля)

проводят при исследовании вирусоскопическим методом мазков, окрашенных по Морозову. Параллельно с обнаружением вирионов оспы исследуют мазки, получаемые путем раздавливания оспенных поражений между двумя стеклами и окрашенные суданом III в течение 10-15 мин. В положительных случаях обнаруживают специфические тельца-включения (тельца Боллингера) в цитоплазме клеток.

Выделение вируса оспы птиц осуществляют путем заражения 10%-ной суспензией, свободной от микрофлоры, развивающихся куриных эмбрионов. Для этого предварительно готовят разведения суспензии (10-2 и 10-3) и заражают четырех эмбрионов на ХАО в объеме 0,2 мл. Погибшие эмбрионы на 3-е сутки, а также выжившие на 6-е сутки охлаждают и вскрывают. В положительных случаях на ХАО обнаруживают отдельно расположенные или слившиеся оспины.

Выделение вируса оспы птиц также осуществляют путем постановки биопробы на курах 3-4- месячного возраста, которых заражают путем втирания суспензии в скарифицированную поверхность гребня, бородок, а также свободные от перьев фолликулы голени. Специфичность оспенных поражений у экспериментально зараженной птицы подтверждают вирусоскопическим методом.

Идентификацию вируса проводят в РИД или РИФ. Указанные серологические реакции могут также быть использованы для обнаружения и идентификации вируса непосредственно в патматериале.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика оспы птиц заключается в обнаружении специфических антител реакцией иммунодиффузии в агаровом геле. Антигеном в реакции служат хорион-аллантоисные оболочки, собранные на 4-5-й день после заражения развивающихся куриных эмбрионов.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная бо-

лезнь опухолевой природы, при которой происходит злокачественное размно-

23

жение клеток кроветворных органов, в результате чего наблюдается диффузная инфильтрация внутренних органов инфицированными клетками. Лейкоз в основном встречается у взрослых животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. При этом развитие болезни характеризуется стадийностью: инкубационный период, бессимптомная стадия (серологическая), гематологическая и опухолевая. Инкубационный период при лейкозе варьирует в больших временных промежутках. На клеточном уровне представляет собой период инфекции после заражения до появления антител. В этот период происходит инфицирование лимфоцитов и нахождение провируса в интегрированном состоянии.

Серологическая стадия характеризуется выработкой антител со стороны организма и продолжается до момента начала усиленного размножения инфицированных лимфоцитов. При опухолевой стадии происходит инфильтрация внутренних органов инфицированными лимфоцитами – диффузно или локально с появлением опухолей. При этом в патологический процесс может вовлекаться костный мозг или лимфоидная ткань, что дало возможность разделять две группы лейкозов. В связи с тем, что неопластической трансформации подвержены различные популяции лимфоцитов, выделяют несколько форм лейкозов. К первой группе лейкозов (с локализацией патологического процесса в костном мозге) относят лимфоидный, миелоидный, слабодифференцированный и недифференцированный лейкозы. К болезням второй группы (с локализацией патологического процесса в лимфоидной ткани) относят лимфосаркому, ретикулосаркому и лимфогранулематоз.

Возбудителем лейкоза КРС является вирус из семейства Retroviridae рода Deltaretrovirus. Все вирусы, входящие в данное семейство, имеют в составе вириона фермент - обратную транскриптазу - обеспечивающий синтез молекулы ДНК на молекуле РНК. Другой отличительной особенностью ретровирусов является их репликация через стадию образования двунитчатой молекулы ДНК (провирус) на вирусной РНК при участии вышеотмеченного фермента с последующей ее интеграцией в клеточный геном клет- ки-мишени. Созревание вирионов происходит путем почкования на клеточных мембранах, чаще без разрушения клеток-хозяев.

В жизненном цикле вируса лейкоза КРС (ВЛКРС) выделяют две его формы: эндогенную и экзогенную. Первая из них представляет собой интегрированный вирусный геном в геном клетки (состояние провируса). Распространение эндогенной формы вируса в организме животного происходит при делении инфицированной клетки и представляет собой передачу вирусного генетического материала дочерним клеткам. Данный путь распространения называется вертикальным неинфекционным путем распространения. Экзогенный онковирус представляет собой зрелую вирусную частицу, распространяющуюся горизонтальным путем (от животного к животному) и вертикальным инфекционным, который в отличие от вертикального неинфекционного характеризуется заражением половых клеток или клеток эмбриона от матери.

24

мунной системы, в первую очередь – фабрициевой бурсы.

Болезнь может протекать в двух формах: острая форма наблюдается у цыплят старше 3-недельного возраста – она характеризуется диарей, апатией, вторичным нефрозом, поражением фабрициевой бурсы, внутримышечными геморрагиями. У цыплят моложе 3-недельного возраста и не содержащих материнских антител инфицирование приводит к иммунодепрессии и развитию вторичных инфекций. Наиболее чувствительны к возбудителю куры и индюшата, у которых болезнь вызывается другим серотипом вируса. Также возможна болезнь у утят, хотя патогенность возбудителя к ним низкая.

Возбудителем инфекционного бурсита птиц является вирус из семейства Birnaviridae, рода Avibirnavirus. Геном вируса представлен двуспиральной линейной фрагментированной на два фрагмента молекулой РНК. В структуре вируса обнаружено пять белков, однако наиболее важным в антигенном отношении является белок, обозначаемый 32Д. Образование антител на данный белок в организме птицы защищает ее от инфицирования, создавая напряженный иммунитет. Выявлено два серотипа возбудителя инфекционного бурсита птиц, что обусловлено различным сочетанием поверхностных структурных белков VP (1,2,3,4, X), однако у цыплят наибольшее значение имеет серотип 1.

Вирус обладает высоким тропизмом к В-лимфоцитам, несущим на своей поверхности рецепторы к иммуноглобулинам класса М. В опытах in vitro доказана устойчивость Т-популяции клеток к патогенному действию вируса. В связи с тропизмом вируса к В-лимфоцитам в патологический процесс при инфекционном бурсите в большей степени вовлечена фабрициева бурса у цыплят в возрасте ее наибольшего функционирования. При этом патогистологические изменения характеризуются некрозом лимфоцитов внутри фолликулов органа с последующим инфильтрированием образующихся вакуолей воспалительным экссудатом с примесью псевдоэозинофилов. В интерфолликулярной зоне отмечается отек и кровоизлияния с разростом соединительной ткани. Также в патологический процесс вовлекаются лимфоидные клетки селезенки, кишечника и почек. Причем поражения почек вызваны главным образом деструктивным действием циркулирующих в крови иммунных комплексов.

Лабораторная диагностика. Инфекционный бурсит относится к трудно диагностируемым болезням в связи с наслаиванием вторичных инфекций и трудностями первичной изоляции вируса при эпизоотической вспышке, поэтому диагностика основана на обнаружении антител в сыворотке крови или вирусного антигена в патматериале иммунологическими и молекулярными методами. Подозрение на инфекционный бурсит должно вызывать внезапное появление болезни с массовыми водянистыми поносами и поражением фабрициевой бурсы.

Отбор патматериала для вирусологического исследования проводят при появлении первых клинических признаков болезни в хозяйстве, так как выделение вируса возможно только в начальный период эпизоотической вспышки. В дальнейшем выявление больной птицы возможно только серологическим исследованием сыворотки крови.

Для лабораторного исследования от птицы берут фабрициеву бурсу,

45

в ядрах клеток лейкоцитов или пораженных клеток органов в виде яркой флуоресценции оранжево-красного цвета.

Выделение вируса осуществляют путем заражения РКЭ 9-11-дневного возраста в аллантоисную полость суспензией материала в объеме 0,2 мл. При этом на каждую пробу материала используют не менее 10 эмбрионов. Инкубацию зараженных эмбрионов проводят в течение 72 часов, после при отсутствии погибших 5 эмбрионов убивают путем охлаждения при 4ºС на ночь. Остальные пять эмбрионов инкубируют до 120 часов, а затем убивают. При этом учитывают срок наступления гибели и по времени гибели эмбрионов определяют вирулентность изолированного штамма.

При отсутствии РКЭ вирус можно выделить на неиммуннной к ньюкаслской болезни птице. Для этого исследуемый материал вводят (0,5мл) внутримышечно цыплятам в возрасте 2-4 мес. При появлении для болезни симптомов птицу убивают в агональном состоянии и берут пробы головного мозга и селезенки для индикации и идентификации вируса.

Индикация вируса в выделенном материале необходима для ориентировочного определения гемагглютинирующего вируса в аллантоисной или амниотической полостях, а также органах вскрытого куриного эмбриона. Для быстрой индикации вируса ставят РГА с эритроцитами кур, морской свинки и обязательно лошади. Постановка РГА с эритроцитами лошади позволяет дифференцировать вирус гриппа птиц в изоляте, который в отличие от вируса ньюкаслской болезни способен их агглютинировать. Для постановки реакции на предметные стекла наносят 5%-ную суспензию эритроцитов и каплю вируссодержащего материала и наблюдают за появлением хлопьев эритроцитов.

Идентификацию вируса ньюкаслской болезни осуществляют в РТГА макро- и микровариантов. Постановка РТГА микрометодом заключается в нанесении на предметное стекло аллантоисной жидкости, содержащей идентифицируемый гемагглютинирующий вирус, капли эталонной специфической сыворотки и капли суспензии эритроцитов. Идентификацию вируса также можно проводить в РИФ по вышеописанной методике, ИФА, РСК. При постановке последней следует иметь в виду, что патогенные велогенные штаммы вируса обладают слабой комплементсвязывающей активностью в отличие от мезо- и лептогенных штаммов.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика ньюкаслской бо-

лезни основана на выявлении специфических антител к возбудителю болезни. В практике используют РТГА, в которой исследуют парные пробы сыворотки крови в присутствии эталонного антигена (в его качестве используют вакцинный штамм La Sota). Результат реакции считают положительным, если разница в титрах первой и второй сывороток составляет не менее трех разведений. Для оценки поствакцинального иммунитета также исследуют желтки яиц от вакцинированной птицы, что имеет некоторые преимущества

перед исследованием сывороток крови птиц серологическим методом. Инфекционный бурсит (болезнь Гамборо, инфекционная бурсальная

болезнь) – остро протекающая болезнь, поражающая чаще всего цыплят 3-6- недельного возраста и характеризующаяся поражением клеток и органов им-

44

В составе вириона присутствуют несколько групп белков, наиболее важными из которых в антигенном отношении является внутренний вирионный белок р24, а также наружный структурный гликопротеин gp51. На наличие внутреннего антигена в организме формируются преципитирующие антитела, а поверхностного гликопротеидного антигена – вируснейтрализующие антитела. Клеткой-мишенью для ВЛКРС является В-лимфоцит, реже – Т-лимфоцит, в геном которых одновременно интегрируется около трех копий ДНК-провируса Провирус изменяет экспрессию клеточных генов, в частности onc гена, вблизи которого происходит интеграция вирусной нуклеиновой кислоты. В результате активизации onc гена начинается усиленное размножение лимфоцитов (трансформация). Кроме того, провирус способен длительно персистировать в организме в интегрированном состоянии. В этом виде вирус обычно защищен от действия антител. Защита организма от инфицирования обусловлена выработкой на поверхностные вирионные гликопротеиды (главным образом gp51) вируснейтрализующих антител. Однако даже при их наличии возможно сохранение и размножение вируса в лимфоцитах, инфильтрирующих ткани в местах, не доступных для действия противовирусных антител.

Лабораторная диагностика лейкоза КРС включает в себя серологическое, гематологическое и гистологические исследования.

Отбор патматериала. Для гематологического исследования берут пробы крови из яремной вены, стабилизированные 10%-ным раствором ЭДТА из расчета 0,02 мл (1 капля) на 1 мл крови. Для гематологического исследования отбирают пробы крови от животных старше 2 лет. Не разрешается брать кровь от животных 15 дней до отела и 15 дней после него.

Для серологического исследования отбирают пробы сывороток крови от животных старше 6-месячного возраста. При этом в лабораторию направляют 5- 6 мл сыворотки в термосе со льдом. Для гистологического исследования отбирают пробы пораженных органов и посылают в свежем виде в термосе со льдом или консервируют 10%-ным формалином.

Серологический метод заключается в постановке РИД в агаровом геле, с помощью которой выявляются противолейкозные антитела в сыворотке крови. Животных, сыворотки которых дали положительный результат в РИД, считают инфицированными вирусом лейкоза, после чего их дополнительно исследуют гематологическим методом.

Гематологический метод основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, главным образом, лимфоидного ряда и слабо дифференцированных клеток.

Повышенное количество лейкоцитов устанавливается путем их подсчета в камере Горяева после обработки крови жидкостью Тюрка по обычной методике. При обнаружении лейкоцитоза из этой же пробы крови готовят мазок на стекле, окрашивают одним из методов (по Романовскому-Гимзе, Паппенгейму, Нохту) и выводят лейкограмму. После этого высчитывают абсолютное число лимфоцитов в крови путем умножения количества лейкоцитов на процент лимфоцитов в лейкограмме. Интерпретацию результатов проводят с использованием лейкозного ключа.

25

Гистологический метод является вспомогательным в диагностике лейкоза и основан на обнаружении инфильтрации внутренних органов лимфоцитами различных популяций. Гистологический метод дает возможность дифференцировать различные формы лейкоза.

Животное считается больным лейкозом при наличии:

-положительного результата однократного гематологического исследования;

-клинических признаков болезни;

-положительного результата гистологического исследования патологического результата.

ЛЕКЦИЯ 5. ВИРУСЫ РЕСПИРАТОРНО-РЕПРОДУКТИВНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ, ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ, ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА СВИНЕЙ (БОЛЕЗНИ ТЕШЕНА)

Респираторно-репродуктивный синдром свиней - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся массовыми абортами у свиноматок на последней стадии супоросности, преждевременными родами, рождением нежизнеспособного приплода и поражением респираторного тракта.

Возбудителем респираторно-репродуктивного синдрома свиней (РРСС) является вирус из семейства Arteriviridae, рода Arterivirus. Это РНКгеномный вирус, содержащий в составе генома плюс-нить РНК. В вирионе РРСС обнаружены 3 структурных белка: нуклеокапсидный (N), капсидный белок М и суперкапсидный белок Е. Вирус впервые был изолирован в 1991 году в Нидерландах при изучении нового заболевания свиней, появившегося в 1987 году в свиноводческих хозяйствах США и Канады. По месту выделения вирус получил также второе название – вирус Лелистад. Биологические характеристики возбудителя остаются малоизученными. Изоляты вируса РРСС различают между собой по патогенности для свиней, действию на клетки и ткани, степени и возможности их репродукции в разных тест-системах, по выраженности бляшкообразования, антигенности, что обусловливает различное проявление болезни у свиней. В настоящее время выделяют две генетические группы вируса РРСС: американскую и европейскую, отличающихся в серологических перекрестных реакциях. Предполагают, что вирус обладает тропизмом к клеткам эндотелия кровеносных сосудов, а также клеткам дыхательной системы. Установлено, что вирус in vitro обладает способностью длительно персистировать в макрофагах, что вероятно обусловливает наблюдаемое в патогенезе болезни состояние иммунодефицита.

Учитывая панзоотический характер распространения инфекции, подозрение на РРСС должно вызывать любое заболевание, сопровождающееся массовыми абортами у свиней. В ряде стран в качестве диагностического критерия приняты три теста: мертворождение не менее 20% свиноматок, аборты и преждевременные роды у 8% и смертность поросят в первую неделю не менее 25%. Совпадение двух из трех критериев позволяет подозревать РРСС.

Для исследования в лабораторию направляют абортированные пло-

26

Таким образом, вирулентные велогенные штаммы вируса могут быть отличены от низковирулентных штаммов по следующим критериям:

1.Способностью распространяться во многие ткани РКЭ после заражения, в то время как авирулентные обладают узкой тканевой специфичностью.

2.Способностью вызывать выраженное цитопатическое действие на культурах клеток в виде бляшек в отличие от слабовирулентных.

3.Различной патогенной активностью в отношении куриных эмбрионов: велогенные штаммы вызывают их гибель через 32-60 часов, мезогенные – через 60-90 часов, лептогенные – более 100 часов.

4.Термостабильностью гемагглютининов велогенных штаммов в отличие от лептогенных (при 56˚С).

Отбор патматериала. Вирус в зависимости от вирулентности и тропизма можно выделить из различных органов (головной мозг, костный мозг, трахея, кишечник, селезенка и др.), поэтому для исследования рекомендуется брать голову, легкие, трахею, селезенку, печень от только что павших или вынужденно убитых птиц. Патматериал необходимо брать только в начале вспышки болезни (в первые 3-5 дней), так как по мере ее развития концентрация вируса резко снижается. Сразу после отбора материал отправляют в лабораторию в термосе со льдом. Допускается консервирование патматериала в стерильном 50%-ном глицерине. Пробы крови для серологического исследования получают путем прокола подкрыльцовой вены или убоя цыплят (5-10) из каждой исследуемой группы. Повторное взятие крови проводят через 15-20 дней.

Подготовка материала включает приготовление суспензии для заражения тест-объектов и препаратов-отпечатков для исследования в РИФ. Суспензию из внутренних органов (1:10) готовят на фосфатно-буферном растворе или МПБ с рН 7,2, после чего центрифугируют 15 минут при 2-3 тыс об/мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг стрептомицина) в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Препараты-отпечатки готовят из печени, почек и селезенки на предметном стекле. При этом мазки должны быть тонкие и ровные, площадью не более 0,8 х 0,8 см по три отпечатка каждого кусочка органа на отдельном стекле. После высушивания на воздухе препараты фиксируют охлажденным ацетоном в течение 4-10 минут.

Лабораторная диагностика проводится по следующим методам:

-первичное обнаружение вируса в патматериале;

-выделение, индикация и идентификация вируса;

-обнаружение антител в сыворотке крови птиц.

Первичное обнаружение вируса в патматериале проводят путем ис-

следования приготовленных препаратов-отпечатков в РИФ. Для обнаружения специфических антигенов применяют гомологичные антитела, меченные РСХ (родаминсульфахлоридом). Использование ФИТЦ-конъюгатов не приемлемо, так как ткани птицы обладают собственной аутофлуоресценцией зеленого цвета. В положительных случаях вирусный антиген обнаруживают

43

геморрагического поражения пищеварительного тракта), параличами конечностей и 100%-ной летальностью. Вторая форма протекает аналогично, но без поражения органов пищеварения (пневмоэнцефалитная форма). Третья форма характеризуется поражением только дыхательной системы, и вызывается мезогенными штаммами вируса (респираторная форма). Четвертая форма вызывается лептогенными штаммами вируса и сопровождается незначительными изменениями респираторного и герминативного тракта.

Возбудителем ньюкаслской болезни является вирус из семейства

Paramyxoviridae, рода Rubulavirus (Avulavirus). У птиц выделяют 9 различных серотипов парамиксовирусов, однако возбудитель ньюкаслской болезни, обозначенный как серотип 1, является серологически обособленным, лишь обладая некоторым антигенным родством с серотипами 3 и 7.

Характерной особенностью вируса ньюкаслской болезни является его различие в патогенности различных штаммов, причем определенная степень патогенности является стабильной и наследуемой в пределах популяции. Различают высокопатогенные штаммы вируса (велогенные штаммы), среднепатогенные (мезогенные) и слабопатогенные (лептогенные). В целом выделяют висцеротропные велогенные штаммы, вызывающие болезнь с геморрагическим поражение желудочно-кишечного тракта; нейротропные велогенные, вызывающие болезнь с респираторными и нервными поражениями; мезогенные, вызывающие болезнь с низкой летальностью и поражением дыхательной системы; лептогенные (респираторные), болезнь от которых характеризуется слабыми клиническими признаками в дыхательной системе и асимптомные кишечные, вызывающие субклиническую форму болезни.

Последние при заражении вызывают у птиц слабую или инаппарантную форму болезни с формированием полноценного иммунитета, поэтому некоторые природные лептогенные штаммы вируса ньюкаслской болезни (La Sota, Бор-73, B1, F) часто используют для иммунизации в качестве живых вакцин. Слабая патогенность лептогенных штаммов вируса болезни обусловлена присутствием в их составе видоизмененного структурного белка F0, не способного трансформироваться в полноценный белок F1. В этой связи авирулентные штаммы вируса проходят в чувствительных клетках цыплят только один цикл репродукции, после чего новой популяции вирусов не образуется.

Вирион ньюкаслской болезни имеет в своем составе несколько белков, одним из которых является гемагглютинин-нейраминидаза (HN), который обусловливает гемагглютинирующую активность в отношении эритроцитов птиц, человека, белой мыши, морской свинки. Гемагглютинирующая активность белка NH разных штаммов ньюкаслской болезни отличается по чувствительности, по температурному воздействию и спектру активности. Как правило, гемагглютинины лептогенных штаммов являются термолабильными при 56˚С в отличие от велогенных штаммов, но обладают более широким спектром активности – способны агглютинировать, кроме того, эритроциты лошади, овец и кошек. Хотя поверхностный белок HN обладает некоторой антигенной изменчивостью, все выделяемые штаммы вируса ньюкаслской болезни различной патогенности в антигенном отношении сходны.

42

ды, от павших – кусочки внутренних органов. Выделение вируса также возможно из плазмы крови. Для серологического исследования направляют пробы сывороток крови свиноматок, взятые через 1-2 мес. после аборта или опороса, поросят до приема ими молозива или от клинически больных поросят. Из доставленного материала в лаборатории приготавливают суспензии по общепринятой методике, которую в дальнейшем используют для выделения вируса на культурах клеток. Наилучшим тест-объектом для выделения вируса является первичная культура клеток альвеолярных макрофагов 2-6-недельных поросят (АМФ) и перевиваемая линия MARC-145. Учет ЦПД проводят через 24, 48, 72, 96 и 120 часов, при этом отмечают округление клеток с последующим пикнозом и отделением от монослоя в течение 2-4 суток. Получаемую культуральную жидкость используют затем в качестве антигена для исследования в варианте ELISA. Также выявление больных и инфицированных животных в хозяйстве возможно при исследовании сывороток крови свиноматок. Выявление антител в сыворотке крови устанавливают путем постановки ИФА, НРИФ, РН.

Трансмиссивный гастроэнтерит свиней - остро протекающая высоко-

контагиозная болезнь, главным образом, поросят до 3-недельного возраста, проявляющаяся диареей и рвотой. Наиболее тяжело болезнь протекает у молодняка и характеризуется сильным поносом, выделением жидких фекалий и гибелью от 100% (у поросят 1-5-дневного возраста) до 70% (у поросят 6-10- дневного возраста). Взрослые животные клинически болеют очень редко, однако длительное время являются вирусоносителями и выделяют вирус с фекалиями во внешнюю среду.

Возбудителем трансмиссивного гастроэнтерита свиней является вирус из семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. Кроме возбудителя трансмиссивного гастроэнтерита свиней данный род включает возбудителей инфекционного бронхита кур, коронавирус диареи новорожденных телят, коронавирус собак, вирус синюшной болезни индюков и некоторые другие. Все они объединены общностью их строения, которое включает наличие плюс-нити РНК, покрытой капсидом и суперкапсидом. Вирионы вируса содержат несколько белков: наружный суперкапсидный белок Е2 и его предшественник, низкомолекулярный капсидный белок Е1, нуклеопротеид N. На поверхности вириона имеются характерные, редко расположенные булавовидные выступы, образующие подобие солнечной короны. Гликопротеиды булавовидных выступов придают вирусу гемагглютинирующую активность в отношении эритроцитов цыплят, морских свинок и крупного рогатого скота. Штаммы вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, выделенные от свиней, серологически идентичны. Однако существует иммунологическое различие между кишечным и культуральным вирусом трансмиссивного гастроэнтерита, которое особенно сильно проявляется после 160 пассажей на культурах клеток. Последний при длительном культивировании in vitro может терять свою иммуногенную активность. Коронавирус собак, вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней и вирус инфекционного перитонита кошек в антигенном отношении очень близки, что дало возможность выделить их в единую антигенную родственную группу агентов внутри семейства

Coronaviridae.

27

Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней обладает тропизмом к эпителиальным клеткам тонкого кишечника, где он реплицируется в цитоплазме цилиндрических клеток ворсинок, вызывая их патологию и деструкцию. Кроме того, вирус обнаруживается при клинической форме болезни в паренхиматозных органах и слизистой оболочке верхних дыхательных путей. У взрослых животных вирус очень редко вызывает патологию кишечных клеток, что обусловлено защитным действием секреторных IgA, однако очень длительно сохраняется, распространяется и даже репродуцируется в макрофагах внутренних органов.

Лабораторная диагностика. Для исследования в лабораторию направляют тонкий кишечник (прежде всего тощую и подвздошную кишку) и мезентеральные лимфоузлы от поросят в начальной стадии проявления клинических признаков болезни. Кроме того, отправляют кусочки паренхиматозных органов. Патологический материал от трупов, пролежавших более 2 часов после гибели, для исследования непригоден. Материал необходимо брать от 9-10 поросят из 3-5 пораженных пометов (по 2-3 поросенка из помета) в количестве 10 г от животного. Отрезок кишки длиной 10-12 см перевозят и берут с содержимым. Пробы материала доставляют в лабораторию в плотно закрытых стеклянных флаконах, помещенных в термос с сухим льдом.

Для серологического исследования направляют парные пробы сывороток крови от свиноматок, в пометах которых обнаружены больные новорожденные поросята, взятые в интервале 21 день.

Подготовка материала. В лаборатории из доставленного материала (отдельно кишечника и паренхиматозных органов) готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса по общепринятой методике и после проверки на бактериальную обсемененность используют для заражения чувствительной биологической системы. Одновременно с приготовлением суспензии готовят препараты-отпечатки из внутренних органов, реже гистосрезы для исследования в РИФ.

Индикацию вируса в патматериале проводят путем исследования проб в РИФ, которую используют в прямом и непрямом вариантах. Наличие ярко-зеленого свечения клеток или их цитоплазмы в виде ярко светящихся гранул различного размера свидетельствует о присутствии вируса. При учете реакции обращают внимание только на специфическое свечение неповрежденных клеток - свечение лейкоцитов и дегенеративно измененных клеток не учитывают.

Выделение вируса производят на первичных и перевиваемых линиях клеток поросят (почек, щитовидной и слюнных желез, тестикул), заражая приготовленной суспензией по 4-8 пробирок с монослоем для каждой пробы. Культуры ежедневно просматривают в течение 5-7 дней для регистрации ЦПД. Особенностью вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней является необходимость предварительной адаптации вируса к культуре клеток, поэтому ЦПД в первых пассажах обычно не наблюдают. В этой связи при отсутствии ЦПД в первом пассаже проводят 5-7 последовательных пас-

28

Для серологического исследования в лабораторию направляют 10-15 проб сывороток крови (по 2-3 мл) от свиноматок с нарушением воспроизводительной функции. Также рекомендуется направлять сыворотку крови от плодов, мертворожденных и новорожденных поросят до приема молозива. Вместе с сывороткой крови от плодов в лабораторию возможно доставлять жидкость из анатомических полостей после хранения их при температуре 4°С в течение ночи. Материал доставляют в термосе со льдом.

Подготовка материала заключается в приготовлении препаратовотпечатков из внутренних органов и обязательно легких плода, так как вирус содержится в тканях только при отсутствии антител, а в присутствии антител – сохраняется в легких. Параллельно с приготовлением препаратов-отпечатков из тканей плода готовят 20-30%-ную суспензию, центрифугируют при 1 тыс об/мин в течение 20 минут, после чего надосадочную жидкость используют в качестве антигена для постановки РГА.

Индикацию и идентификацию вируса проводят в РГА и РИФ. Для по-

становки реакции гемагглютинации используют 0,6%-ную взвесь эритроцитов морской свинки на фосфатном буфере. Реакцию проводят при температуре 4°С с ее учетом после 60 минут инкубации.

В реакции иммунофлуоресценции исследуют препараты-отпечатки из внутренних органов абортированных плодов. При совпадении результатов диагностической индикации (в РГА) и серологической идентификации вируса (в РИФ) ставят окончательный диагноз.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика основана на выяв-

лении специфических антител в сыворотке крови свиноматок и плодов. С этой целью осуществляют постановку РТГА с использованием диагностического набора ВИЭВ и ВГНКИ. Сыворотки от свиноматок и плодов исследуют в реакции в разведениях от 1:8 до 1:16384, которые смешивают с 4 ГАЕ антигена и после часового контакта при комнатной температуре к смеси добавляют 0,6%- ную суспензию эритроцитов морской свинки. Результат реакции учитывают через 2-3 часа инкубации при 4°С.

Диагноз считают установленным в случае обнаружения в двух и более из числа доставленных для исследования пробах специфических антител в разведениях 1:64 и выше. Для серодиагностики болезни можно использовать реакцию микронейтрализации в пластиковых панелях с круглодонными лунками, РИД и ELISAвариант ИФА.

ЛЕКЦИЯ 7. ВИРУСЫ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ, ИНФЕКЦИОННОГО БУРСИТА, ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА, БОЛЕЗНИ МАРЕКА, ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР

Ньюкаслская болезнь – высококонтагиозная вирусная болезнь, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, геморрагическим диатезом и поражением внутренних органов.

Из-за сильного разнообразия симптомов болезни различают четыре ее формы. Первая форма вызывается велогенными штаммами вируса и характеризуется одновременным поражением органов дыхания и пищеварения (в виде

41

для его репликации требуется фермент ДНК-полимераза, содержащийся в высоко активном состоянии в S- фазе клеточного цикла. В этой связи заражение культур клеток целесообразно проводить в период их логарифмического роста, когда сформировалось только 30-50% монослоя. Из первичных культур клеток рекомендуется использование культур клеток почек (РК-15) и тестикул (ST) поросят. Перевиваемые культуры клеток человека (HeLa, Hep-2, KB, FL-Amnion) признаны контаминированными парвовирусами свиней. Размножение парвовируса свиней в первичных и перевиваемых культурах клеток сопровождается развитием цитопатического эффекта, который характеризуется диффузной зернистостью и округлением клеток, отделением их от стекла и частичным или полным разрушением клеточного монослоя.

Учитывая высокую вероятность спонтанной контаминации используемых в лабораториях культур клеток, рекомендуется проводить их деконтаминацию путем серийного пассирования их в присутствии специфической сыворотки (1%) в ростовой среде. Перед использованием культуры рекомендуется исследовать с целью исключения парвовирусной контаминации по РГА и гемадсорбции эритроцитов морских свинок.

Парвовирус агглютинирует эритроциты морской свинки, цыплят, крыс, мышей и некоторых других животных и не агглютинирует эритроциты барана, лошадей, свиней, крупного рогатого скота. Для постановки реакций чаще используют эритроциты морской свинки, реакцию проводят при температуре 4°С, в качестве разбавителя используют фосфатно-буферный раствор.

Лабораторная диагностика. На наличие в хозяйстве парвовирусной инфекции могут указывать признаки нарушения воспроизводительной способности свиноматок, однако окончательный диагноз ставят на основании результатов лабораторного исследования.

Постановка диагноза на парвовирусную инфекцию свиней путем выделения вируса из патматериала является малопригодным диагностическим тестом, так как выделить возбудитель из погибших и мумифицированных плодов удается не всегда. Кроме того, используемые для изоляции вируса культуры клеток зачастую бывают изначально контаминированными парвовирусами, что может приводить к диагностическим ошибкам.

Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции свиней проводится по следующим направлениям:

-индикация и идентификация возбудителя непосредственно в патматериале путем постановки РГА и РИФ;

-обнаружение специфических антител в сыворотке крови больных животных.

Отбор патматериала. На исследование направляют мумифицированные плоды не позднее 70 дней супоросности (длиной менее 16 см) или легкие от них. Инфицированные плоды позднее 70 дней супоросности обычно содержат вместе с антигенами антитела, что мешает выявлению вируса и вирусного антигена.

40

сажей до наступления характерных цитопатических изменений.

ЦПД вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней характеризуется: 1) набуханием, утолщением с последующим укорочением клеток до полного разрушения монослоя, а также 2) образованием синцитиев, содержащих от 2-5 до 40 ядер в одной клетке. Тельца-включения при заражении культуры клеток вирусом трансмиссивного гастроэнтерита не регистрируют. Одновременно с выделением вируса на культурах клеток целесообразно проводить выделение вируса путем заражения 2-3-дневных поросят, что обусловлено большим процентом штаммов вируса трансмиссивного гастроэнтерита, не обладающих выраженным ЦПД на культурах клеток. Экспериментальным двум-трем животным per os вводят 3-5 мл исследуемого материала или (реже) закапывают в носовые ходы. За поросятами наблюдают 72-96 часов с постоянной термометрией. Появление рвоты и диареи в течение 24-72 часов после заражения свидетельствует о присутствии вируса трансмиссивного гастроэнтерита в материале. На 3-5-й день после заражения животные погибают, после чего их вскрывают, отмечают патологоанатомические изменения и отбирают патматериал для вирусологического исследования. Предпочтительным является убой животных с диагностической целью через 24 часа после появления диареи.

Идентификацию изолированного в культуре клеток вируса осуществляют при помощи РИФ, а также РН. Реакцию нейтрализации проводят на культурах клеток, используя постоянные дозы изолируемого вируса и сыворотки. Для этого к 0,5 мл исследуемого вируса с содержанием 1000 ТЦД50 в 0,1 мл добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки, содержащей 20 нейтральных доз в 0,1 мл. После инкубирования смеси при 37ºС в течение 60 минут проводят заражение приготовленной смесью в объеме 0,2 мл четырех пробирок с культурой клеток. Учет проводят на 4-е и 7-е сутки. РН считается положительной, если специфическая сыворотка нейтрализует цитопатическое действие вируса в 50% пробирок, зараженных смесью вирус-сыворотка.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика проводится с целью постановки диагноза на прошедшую инфекцию или эпизоотологического исследования поголовья свиноматок и поросят.

Главной реакцией для выявления антител в сыворотке крови является РНГА с использованием промышленно выпускаемого эритроцитарного диагностикума. Для выяснения благополучия в хозяйствах-репродукторах два раза в год исследуют 5% поголовья свиней. Положительной считается сыворотка, которая в разведениях 1:16 и выше вызывает агглютинацию эритроцитарного диагностикума.

Кроме РНГА возможно использование РН с целью выявления титра антител в парных пробах сыворотки крови. В реакции используют постоянную дозу вируса (100-1000 ТЦД50) и двукратные разведения испытуемой сыворотки, которую предварительно инактивируют в течение 30 минут при 56ºС. При массовых исследованиях целесообразно использовать РН в варианте микрометода на микропланшетах.

Также для выявления антител рекомендовано использование РТГА, ИФА (твердофазный метод).

29

Энзоотический энцефаломиелит свиней (болезнь Тешена) - ви-

русная болезнь свиней, характеризующаяся развитием негнойного энцефаломиелита и параличами. Болезнь проявляется симптомами поражения центральной нервной системы в виде гиперстазии, тонико-клонических судорог, параличей конечностей, мышц шеи и глотки. Заражение происходит алиментарно, после чего вирус размножается в клетках желудочно-кишечного тракта,

вкоторых он обнаруживается через 24-72 часа после заражения. Затем в патогенезе болезни отмечают короткую виремию, в период которой вирус гематогенно и нейрогенно проникает в центральную нервную систему. Возбудитель обнаруживается в ЦНС только в течение первых дней паралитической стадии болезни, причем в более высоких концентрациях в шейном и грудном отделах спинного мозга и мозжечка. К 5-му дню после появления симптомов болезни содержание вируса в клетках ЦНС резко снижается, и к моменту гибели вирус

ворганизме обнаружить невозможно (феномен аутостерилизации). Возбудителем болезни Тешена является вирус из семейства

Picornaviridae, рода Enterovirus. Вышеуказанный род является наиболее многочисленным внутри семейства и включает полиовирусы человека и мышей, возбудителей везикулярной болезни свиней, энцефаломиелита птиц и др. Для вирусов данного рода характерно широкое носительство среди клинически здоровых хозяев, а также узкий спектр патогенности. Вирус болезни Тешена на основании серологических тестов, характера ЦПД и культуральным свойствам делят на 13 серотипов, разделенных на 3 серогруппы, причем основным возбудителем болезни считается энтеровирус свиней серотипа 1 (ЭВС-1). Кроме него в природе встречаются другие энтеровирусы, вызывающие у молодняка поросят энцефаломиелитный синдром.

Возбудителем болезни Тешена является РНК-геномный вирус, имеющий в составе вириона единую молекулу плюс-нити РНК. Выявлено четыре главных структурных полипептида, которые, объединяясь друг с другом, формируют капсомер. В составе капсида имеется 60 капсомеров единой формы и величины.

Лабораторная диагностика болезни Тешена включает в себя как вирусологические, так и гистологические методы, однако решающее значение имеет вирусологическое исследование.

Отбор патматериала. Чаще отбирают кусочки из различных отделов спинного и головного мозга, прежде всего коры больших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга, отдельные сегменты шейной и поясничной части спинного мозга. Возможно выделение вируса также из фекалий животных. Обычно берут смывы из прямой кишки, однако из кишечника многих свиней часто изолируют сиротские энтеровирусы, схожие по свойствам с возбудителем болезни Тешена, но, как правило, имеющие малое диагностическое значение. При взятии материала следует учитывать, что вирус в максимальной концентрации содержится в тканях центральной нервной системы в конце инкубационного периода или в самом начале (на протяжении 1-2 дней) паралитической стадии. В этой связи патматериал отбирают только от животных, убитых с диагностической целью в начале болезни (не позднее 3-5-го дня). После

30

антител можно судить о количестве хронических и субклинических случаев болезни. Основной серологической реакцией является НРИФ, в которой в качестве антигена используют монослой, полученный из лейкоцитов свиней и зараженный вирусом африканской чумы свиней. Также аналогичная задача может быть выполнена РТГАд, РСК и РРИД.

Парвовирусная инфекция свиней - контагиозная вирусная болезнь,

проявляющаяся клинически только у супоросных свиноматок и характеризующаяся прохолостами, малочисленными пометами, рождением мумифицированных плодов, мертвых и слабых поросят и реже абортами.

Заражение животных происходит пероральным или аэрогенным путем, после чего вирус в течение недели присутствует в крови (виремия), что сопровождается незначительной лейкопенией и кратковременным повышением температуры. В период виремии вирус проходит через плаценту и инфицирует эмбрионы и плоды. В случае инфицирования эмбрионов в раннюю стадию супоросности (до 36 дней) они погибают и рассасываются. У зараженных на 36-56-й день супоросности часть или реже все плоды погибают и мумифицируются; мертворождение происходит при инфицировании свиноматок на 56-70-й дни супоросности. После 70—го дня супоросности плоды в большинстве случаев становятся устойчивыми к патогенному действию вируса, но после рождения являются носителями одновременно вируса и антител. У небеременных свиноматок и хря- ков-производителей вирус не вызывает патологических изменений в организме. Остается мало выясненным патогенное действие парвовируса свиней на организм поросят. В последнее время вирус выделен из содержимого тонкого кишечника поросят 2-3-недельного возраста с диарейным синдромом и везикулярными поражениями.

Возбудителем парвовирусной инфекции свиней является вирус из семейства Parvoviridae, рода Parvovirus. Данный вирус вызывает у свиней болезнь репродуктивных органов, иначе называемую болезнью СМЕДИ (сокращение от синдрома, проявляющегося мертворождением, мумификацией, смертью эмбрионов, бесплодием). Как было установлено, клинически схожее синдрому СМЕДИ заболевание может также вызываться вирусами других родов, в частности энтеровирусами пяти типов. В настоящее время возбудителем синдрома СМЕДИ признан только парвовирус свиней Parvovirus suis. Это ДНК-содержащий вирус, геном которого представлен однонитевой молекулой ДНК. Вирус содержит три структурных полипептида молекулярной массы 83, 64 и 60 кД, обозначаемых как А, В и С. Различные штаммы парвовирусов свиней сходны по антигенной структуре и не имеют антигенного родства с парвовирусами других животных за исключением парвовируса собак, между которыми имеются слабо выраженные антигенные связи. Простое строение вириона обусловливает высокую устойчивость возбудителя во внешней среде, в частности способны выдерживать воздействие температуры 70°С, а также действие различных сред в диапазоне рН от

3,0 до 9,0.

Вирус является патогенным только для свиней. В лабораторных условиях вирус культивируют в первичных и перевиваемых культурах клеток. В любом случае вирус нуждается в наличии интенсивно размножающихся клеток, так как

39