Частная_ISBN-NEW

Учебное издание

Корочкин Рудольф Борисович Гласкович Алевтина Абликасовна

КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ПРЕДМЕТУ «ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ»

Учебно-методическое пособие

Ответственный за выпуск А.А. Вербицкий Технический редактор Р.И. Тихонова Компьютерный набор и верстка Корочкин Р.Б. Корректор И.Н Пригожая

Издатель и полиграфическое исполнение УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»

ЛИ №: 02330/0133019 от 30.04.2004 г. 210026, г. Витебск, ул. 1-я Доватора, 7/11.

Тел. 8(0212) 35-99-82.

Учреждение образования «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия

ветеринарной медицины»

Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович

КУРС ЛЕКЦИЙ ПО ПРЕДМЕТУ «ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ»

Учебно-методическое пособие для студентов по специальности 1-74 03 02 «Ветеринарная медицина»

ВИТЕБСК

ВГАВМ

2008

УДК 619:578(075.8)

ББК 48 я73

К68

Рекомендовано в качестве учебно-методического пособия редакционно-издательским советом УО «Витебская ордена «Знак

Почета» государственная академия ветеринарной медицины» от 2008 г. (протокол № )

Авторы:

канд. вет. наук, доц. Корочкин Р.Б, канд. вет. наук, доц. Гласкович А.А.

Рецензенты:

д-р вет. наук, проф. Прудников В.С., канд. вет. наук, доц. Машеро В.А

Корочкин, Р.Б.

Курс лекций по предмету «Частная вирусология»: учеб.- метод. поК68 собие / Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович. – Витебск: ВГАВМ, 2008 –

68с.

ISBN 978-985-512-084-2

Учебно-методическое пособие написано в соответствии с программой по дисциплине «Вирусология» для высших с.-х. учебных заведений по специальности 1-74 03 02 «Ветеринарная медицина». Содержит в себе девять лекций по предмету «Частная вирусология», излагающих основные биологические характеристики вирусоввозбудителей болезней животных, характеристику вызываемых ими болезней, лабораторную диагностику инфекций. Учебно-методическое пособие предназначено для преподавателей и студентов факультета ветеринарной медицины.

УДК 619:578(075.8)

ББК 48 я73

ISBN 978-985-512-084-2 © Р.Б. Корочкин, А.А. Гласкович, 2008

© УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины, 2008

Кафедра микробиологии и вирусологии:

-проводит фундаментальные и прикладные исследования по изучению этиологии, патогенеза, методов диагностики и профилактики инфекционных болезней животных, консультативную, научную, методическую помощь сотрудникам, аспирантам и соискателям академии, а также другим научным учреждениям страны и ближнего зарубежья;

-осуществляет научно-практическую помощь сельскохозяйственным предприятиям республики.

По вопросам сотрудничества обращаться по следующему адресу:

210026 РБ, г.Витебск, ул.1-я Доватора, 7/11 Кафедра микробиологии и вирусологии

E-mail: niivsavm@tut.by

► по долговременному научному сотрудничеству с научными организациями, учебными учреждениями, сельскохозяйственными предприятиями – тел/факс +375212 37 20 41 (кафедра, заведующий – Вербицкий Анатолий Анатольевич)

► по вопросам организации консультативной помощи и лабораторных исследований по диагностике инфекционных болезней тел/факс +375212 37 20 41 (кафедра, доценты: Поляков Олег Николаевич, Алешкевич Виталий Николаевич).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин [и др]. – Москва:

ВНИТИБП, 1998. – 928 с.: ил.

2.Павлович, С.А. Основы вирусологии: учеб. пособие / С.А. Павлович. – Минск: Выш. шк., 2001. – 192 с.: ил.

3.Сюрин, В.Н. Диагностика вирусных болезней животных : справочник / В.Н. Сюрин [и др.]. – Агропромиздат – 1991. – 528 с.: ил.

4.Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология : учебник для вузов по специальности «Ветеринария» / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина – 2-е изд., перераб. и доп. – Москва : Агропром-

издат, 1991. – 432 с.: ил.

5.Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология : справочная книга. – Москва : Колос, 1979. – 472 с. : ил.

6.Diagnostic Microbiology. Color and Textbook. / E.W. Koneman [et all.].- Philadelphia, 1988. – 840 p.

7.Presscott, L Microbiology / L. Prescott, J.P. Harley, D.A. Klein. - Dubuque, Iowa, 2000. – 912 p.

8.Nester, E.W. Microbiology : A human perspective / E.W. Nester, C. Evans Roberts, M.T. Nester - Dubuque, Iowa, 2002. – 799 p.

9.Viral diseases of cattle / R.F. Kahr [et all.].- Iowa, 1981. – 299 p.

СОДЕРЖАНИЕ

Лекция 1. Вирусы болезни Ауески, бешенства, ящура …...…….....……..... 4 Лекция 2. Вирусы гриппа, парагриппа-3, инфекционного

ринотрахеита …………………………………………………………..…. 10

Лекция 3. Вирусы диареи, аденовирусной инфекции …...…………...…… 16 Лекция 4. Вирусы оспы млекопитающих и птиц. Вирус лейкоза

крупного рогатого скота ………………………………………………… 20 Лекция 5. Вирусы респираторно-репродуктивного синдрома свиней,

гастроэнтерита свиней, энзоотического энцефаломиелита

(болезни Тешена) …..…….........................................................…………. 26

Лекция 6. Вирусы европейской и африканской чумы свиней.

Вирус парвовирусной инфекции свиней ……………………………….. 33 Лекция 7. Вирусы ньюкаслской болезни, инфекционного бурсита,

инфекционного ларинготрахеита, болезни Марека, инфек-

ционного бронхита кур ………………………………………………….. 41

Лекция 8. Вирусы плотоядных (чума плотоядных, парвовирусный энтерит плотоядных, алеутская болезнь норок)……………………..…. 56

Лекция 9. Прионные болезни животных (спонгиоформная энцефалопатия крупного рогатого скота, скрепи овец).……………………………….... 63

ЛЕКЦИЯ 1. ВИРУСЫ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ, БЕШЕНСТВА, ЯЩУРА

Болезнь Ауески - остро протекающая болезнь сельскохозяйственных животных, пушных зверей и грызунов, характеризующаяся признаками поражения головного и спинного мозга, сильным зудом и расчесами (у всех животных, кроме свиней).

Усвиней клиническое проявление болезни Ауески различно, но во всех случаях без зуда. У свиней, зараженных внутриутробно и в первые 10 дней жизни, болезнь носит септический характер. Признаки поражения центральной нервной системы характеризуются судорогами мышц по всему телу. Гибель наступает через 4-12 часов после проявления первых клинических признаков.

Упоросят в возрасте 10 дней- 3 месяца клиническая картина характеризуется высокой лихорадкой (до 42ºС), слизистыми истечениями из носа. Затем появляются признаки поражения центральной нервной системы – беспокойство, манежные движения, судороги шейных и жевательных мышц, мышц позвоночника и всего тела. Гибель при этой форме достигает 70-100%.

Усвиноматок и подсвинков старше 5 месяцев болезнь проявляется в виде доброкачественной формы с поражением дыхательной системы и обильным слюнотечением. Через 3-4 дня животное выздоравливает, а признаки поражения центральной системы проявляются редко. Супоросные свиноматки могут абортировать. В природе существует циркуляция слабовирулентных штаммов вируса болезни Ауески, характеризующихся низким нейротропизмом. Эти штаммы вируса зачастую вызывают только носительство у свиней.

Укрупного рогатого скота болезнь характеризуется лихорадкой и сильным зудом в области головы, реже – на других участках тела. Случаи выздоровления очень редки. У мелкого рогатого скота клиническая картина болезни Ауески аналогична, однако признаки возбуждения животного появляются очень редко. У плотоядных животных болезнь Ауески характеризуется сильным зудом, беспокойством и возбуждением без признаков агрессивности (в отличие от бешенства). Во всех случаях плотоядные, в отличие от других животных, не выделяют вирус во внешнюю среду, являясь таким образом экологическим тупиком. У лошадей болезнь протекает преимущественно доброкачественно.

Возбудителем болезни Ауески является вирус из семейства Herpesviridae рода Varicellavirus. Вирус пантропен и сразу после заражения появляется в верхних дыхательных путях и легких, а через 48 часов может обнаруживаться в головном мозгу, селезенке, печени и других органах. Первично вирус попадает в носоглотку, затем распространяется по организму лимфагенным и нейрогенным путем. При проникновении через кожу вирус первично реплицируется в подкожной клетчатке, затем лимфагенно и гематогенно распространяется по всему организму. У павших животных наивысшая концентрация вируса обнаруживается в миндалинах, лимфатических узлах области головы и легких, что следует учитывать при отборе патматериала.

4

ном клеток и выполняет функции стабилизации цитоплазматической мембраны. Одни ученые считают, что инфекционным агентом является видоизмененный PrP клеток, который, контактируя со здоровой клеткой, изменяет конформацию белка или же активизирует фермент, вызывающий модификацию клеточного PrP. Данная гипотеза плохо согласуется с установленным фактом наличия нескольких генетических штаммов у отдельных возбудителей прионных болезней.

Диагноз на медленные инфекции основывается на эпизоотологических и клинических данных, а также результатах лабораторного исследования. Для лабораторной диагностики отправляют голову погибших животных. Лабораторная диагностика заключается в выявлении характерных изменений в головном мозгу гистологическим методом, а в спорных случаях – в постановке биопробы на белых мышах.

Гистологическое исследование заключается в обнаружении патогистологических изменений в сером мозговом веществе стволовой части головного мозга, главным образом в продолговатом мозге и варолиевом мосту. Неспецифические альтеративные изменения представлены набуханием нейронов, очаговым или диффузным распылением хроматофильного вещества, хроматолизом, неравномерным гиперхроматозом. Специфическими изменениями, имеющими диагностическое значение, считается массовая вакуолизация нейронов, приводящая к лизису нервных клеток. За диагностическое количество принимается обнаружение не менее 15 вакуолизированных нейронов. В сомнительных случаях возможна постановка биопробы.

Биопроба проводится на белых мышах, которых заражают интрацеребрально суспензией ткани головного мозга больного животного. При этом у экспериментальных животных отмечается формирование в клетках головного мозга характерных патогистологических изменений.

Cпецифическими методами диагностики прионных болезней является иммуноблотниг, основанный на идентификации белка PrPSc с помощью меченных иммунолобулинов в тканях мозга после гомогенизации и электрофорезе в геле, а также иммуногистохимическим методом в замороженных гистосрезах головного мозга.

К современным методам диагностики относят также использование ДНКзондов для обнаружения генов, ответственных за генетическую предрасположенность к прионным болезням.

65

ным данным в начале 80-х годов (1981 – Стонлей впервые изолировал возбудителя скрепи; 1982 – С. Прузинер). Многочисленными физико-химическими опытами была установлена устойчивость агента к УФ-облучению, ионизирующей радиации, ультразвуку, нуклеазам, чувствительность к протеазам (как у белков), высокая чувствительность к окисляющему действию периойодата (как у полисахаридов).

На основании этих исследований инфекционный агент бал признан специфическим сиалогликопротеином с массой 27-32 кД (в 100 раз меньше самого малого вируса по массе), не содержащий нуклеиновой кислоты. Этот белок получил собственное название PrPSc. Причем многие ученые полагают, что основой всех нетрадиционных вирусов является один гидрофобный скре- пи-специфический белок.

После очистки инфекционного материала агент был обнаружен в электронном микроскопе. При этом все прионы имеют вид палочек, которые состоят из агрегатов белка PrP. Эти фибриллы, называемые сейчас скрепиассоциированные фибриллы, считают материальным субстратом нетрадиционных вирусов. Их размер составляет 100х10-20 нм. Располагаются парами, удвоение их происходит в среднем за 5,2 суток. Причем морфологически фибриллы напоминают спиральные филаменты нейрофибриллярных сплетений и амилоидные фибриллы.

Прионы устойчивы к физическим факторам, особенно если они находятся в состоянии агрегации с клеткой. Они выдерживают кипячение в течение 30 минут, устойчивы к воздействию ферментов ДНК-аза и РНК-аза, устойчивы в 12%-ном формалине. Кроме того, прионы не антигены, не чувствительны к интерферону, не интерферируют с другими вирусами.

Углубленное изучение прионов, а также безуспешные попытки выделить из них нуклеиновые кислоты выдвинуло несколько гипотез о природе и механизме репликации прионов, однако все они противоречат центральной догме молекулярной биологии о том, что поток генетической информации в клетке всегда направлен от нуклеиновой кислоты к белку. Это положение ставит под сомнение инфекционность самих прионов, рассматривая их только как следствие автокаталитических процессов в клетке. Тем не менее, многочисленными опытами по заражению и перезаражению тест-объектов была доказана инфекционность прионов, так как были воспроизведены все звенья триады Коха.

Хотя возможно получение иммунных сывороток путем иммунизации лабораторных животных высокоочищенным белком PrP, в организме больных животных и человека антител до сих пор выявить не удалось. Полагают, что в пораженных клетках антигенные детерминанты агента полностью замаскированы от иммунной системы.

Патогенез развития медленных инфекций на клеточном уровне, а также механизм репликации прионов до сих пор остается невыясненным. Установлено, что на поверхности нормального нейроцита у всех животных и человека присутствует белок, схожий структурно и инфекционным агентом. Его называют PrPC нормальной ткани. Данный гликопротеин закодирован ге-

64

Для вируса характерна длительная персистенция в организме переболевшего животного – у свиноматок свыше 180 дней. В природе важным резервуаром являются мыши и крысы.

Лабораторная диагностика болезни Ауески основана на выделении вируса из патматериала с последующей его идентификацией, а также выявлении специфических антител в крови переболевших животных.

Патматериалом для выделения вируса является головной мозг, кусочки легких, селезенки, печени, лимфоузлов, миндалин, при жизни вирус может быть выделен из носовых секретов, от абортировавших животных исследуют плоды. При отборе патматериала следует учитывать неравномерное распространение вируса в разных участках головного мозга, поэтому отбирают минимум по 2-3 пробы из разных участков мозга (обычно мозжечка, продолговатого и больших полушарий головного мозга). Патматериал доставляют в термосе со льдом или допускают его консервирование в 50%-ном глицерине. В сопроводительном документе обязательно указывают срок последней вакцинации и название вакцины.

Подготовка материала. В лаборатории делают гистосрезы из тканей мозга, а из оставшейся массы материала готовят 10%-ную суспензию по общепринятой методике. При этом кусочки из разных отделов мозга целесообразно объединять в общую пробу. После подготовки материала гистосрезы используют для исследования в РИФ, а суспензию – для постановки биопробы.

Реакцию иммунофлуоресценции проводят с использованием люминесцентных иммунных сывороток. В положительных случаях обнаруживают полосы флуоресцирующих нейронов. При этом в препаратах из мозжечка флуоресцирующие клетки располагаются более беспорядочно. Во всех случаях специфическая флуоресценция характеризуется свечением в виде пыли или мелких гранул. Положительный результат РИФ должен быть обязательно подтвержден результатами постановки биопробы.

Биопроба. Приготовленную суспензию вводят кроликам внутримышечно или подкожно в объеме 1 мл, а оставшуюся часть суспензии хранят при низкой температуре до конца экспертизы. Инкубационный период составляет 36-48 часов, реже – несколько дней. Положительный результат биопробы характеризуется либо признаками поражения центральной нервной системы у кроликов – возбуждение, затем параличи конечностей и гибель, либо сильным зудом на месте введения. Если кролики погибают без наличия вышеуказанных признаков, то биопробу повторяют, используя патматериал от павшего животного.

Биопробу считают положительной при наличии характерной клинической картины с последующей гибелью кролика через 2-10 дней. В случае отрицательного или сомнительного результата биопробы проводят выделение вируса на культурах клетках.

Выделение вируса на культурах клеток. Второй частью приготовлен-

ной суспензии заражают культуры клеток по общепринятой методике. Для выделения вируса используют первичные субкультуры (почек или щитовидной железы свиньи, фибробластов РКЭ), а также перевиваемые культуры клеток

5

(РК-15, ВНК-21). Репродукция вируса болезни Ауески характеризуется развитием ЦПД на 4-5-й день после заражения: в культурах клеток из эпителиальных и эмбриональных клеток происходит образование синцития с последующим отслаиванием монослоя, из фибробластов РКЭ – округление клеток, зернистость и вакуолизация. В случае отсутствия ЦПД в культурах клеток на 5-й день культивирования проводят повторный пассаж. Однако общее количество слепых пассажей не должно превышать 3-5 из-за снижения вирусом своей вирулентности. При наличии характерного типа ЦПД выделенный вирус должен быть идентифицирован в РН.

Идентификация вируса. Идентификацию вируса в РН осуществляют на культуре клеток того же вида, где вирус был изолирован. Для этого используют культуральную жидкость, из которой готовят десятикратные разведения (10-1- 10-7), положительную и отрицательную сыворотку, которые в реакции используют в разведении. 1:10. Учет РН на культурах клеток проводят через 2-5 суток. Вирус считается идентифицированным, если индекс нейтрализации составляет 2 lg (100 раз).

Серологическую диагностику болезни Ауески проводят в виде плановых исследований свинопоголовья хозяйств-поставщиков, а также при определении степени благополучия хозяйства по болезни Ауески. Она основана на выявлении специфических антител в сыворотке крови переболевших животных.

Наличие антител определяют в РН на культурах клеток, определяя титры вируснейтрализующих антител в сыворотке. В реакции используют двукратные разведения исследуемой сыворотки (от 1:2 до 1:16) и постоянную дозу вируса (1000 ТЦД50 / 0,1 мл).

Ящур - остро протекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистой оболочки рта, кожи венчика и вымени; у молодых животных – поражением миокарда скелетных мышц. У взрослых животных болезнь протекает доброкачественно и сопровождается появлением на поверхности губ, языка, слизистой оболочки щек везикул, наполненных жидкостью (афты). Часто в патологический процесс могут вовлекаться конечности и вымя.

Возбудителем ящура является вирус из семейства Picornaviridae рода Aphtovirus. Это РНК-геномный вирус, содержащий в составе вириона нефрагментированную линейную плюс-нить РНК. Молекула нуклеиновой кислоты покрыта белковой оболочкой (капсидом), которая состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии. Капсид построен из четырех основных структурных полипептидов, обозначаемых VP1, VP2, VP3, VP4, первый из которых ответственен за образование вируснейтрализующих антител.

В антигенном отношении вирус ящура неоднороден и обладает плюрализмом. В настоящее время известно 7 антигенных типов вируса ящура: А, О, С, SAT1, SAT2, SAT3 и Азия. Серотипы А, О, С распространены повсеместно, тип Азия 1 выявлен только в азиатских странах, серотипы SAT регистрируются в Африке. Кроме того, внутри основных типов существуют подтипы, или сероварианты, количество которых различно у каждого серотипа.

6

единицах экстинкции, умноженных на сто. У здоровых норок пробы колеблются от 0 до 4 ед., показатели 4,1-7 ед. считаются сомнительными, величина выше 7 ед. свидетельствует о болезни у исследуемого животного.

Изменение белкового состава крови при болезни можно также обнаружить методом электрофореза сывороточных белков. Установлено, что при алеутской болезни норок уровень гамма-глобулина превышает 14,9%. Недостатками неспецифических тестов диагностики алеутской болезни норок является невозможность диагностирования бессимптомной стадии болезни, а также получение положительных результатов в случае других неинфекционных поражений печени, желчного пузыря и почек.

К специфическим серологическим реакциям относят реакцию иммуноэлектроосмофореза (РИЭОФ), где в качестве антигена используют фреоновые экстракты внутренних органов экспериментально зараженных норок, а в качестве антитела – исследуемую сыворотку больных животных. РИЭОФ является основной для прижизненной диагностики алеутской болезни норок и широко используется в зверохозяйствах, где ежегодно в мае-июне исследуют всех самок без приплода, а также всех вновь поступающих в благополучные хозяйства норок.

Также для выявления антител разрабатывается ELISAметод, который позволяет диагностировать зараженных животных в бессимптомную непрогрессирующую стадию.

ЛЕКЦИЯ 9. ПРИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ (СПОНГИОФОРМНАЯ ЭНЦЕФАЛОПАТИЯ КРС, СКРЕПИ ОВЕЦ)

Спонгиоформная энцефалопатия крупного рогатого скота – медленная инфекция, характеризующаяся повышенной пугливостью, мышечной дрожью, нарушением координации движений, а в последующем агрессивностью, которая сменяется состоянием коллапса, параличами и гибелью животных.

Скрепи овец – медленно прогрессирующая болезнь овец и коз, протекающая с симптомами поражения центральной нервной системы, сильным зудом и развитием в головном и спинном мозге дегенеративных изменений.

Спонгиоформная энцефалопатия КРС и скрепи овец относят к группе медленных инфекции. Медленные инфекции (спонгиоформные энцефалопатии)- группа болезней животных и человека, характеризующихся длительным инкубационным периодом, множественными нейропатологическими изменениями в форме разрушения нейронов, астроглиоза, спонгиоформных изменений мозговой ткани и заканчивающихся неминуемой смертью больного организма.

Кроме названных, медленные инфекции обнаруживаются у других видов животных (трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь лосей, спонгиоформная энцефалопатия кошачьих, экзотическая энцефалопатия копытных антилоп) и человека (куру, болезнь Крейтцфельд-Якоба, синдром Герстмана-Штройслера-Шайнкера, смертельная семейная бессонница).

Все медленные инфекции вызываются инфекционными агентами, называемыми нетрадиционными вирусами, или чаще прионами. Последнее название происходит от английских слов proteinaceous infectious particles. Хотя скрепи у овец была известна уже 250 лет назад, впервые прионы были изолированы по раз-

63

комплексно с учетом эпизоотологических, клинических и лабораторных данных. Лабораторная диагностика основана на обнаружении характерных патоморфологических изменений во внутренних органах павших животных, а также серологического исследования при жизни животного. Присутствие вируса в зараженном организме в комплексе с антителами не дает возможности культивировать, индицировать и идентифицировать вирус, поэтому лабораторная диагностика основана на обнаружении специфических антител в сыворотке крови больных животных, либо на выявлении повышенного количества гамма-глобулинов (косвенный неспецифический метод диагностики).

Отбор патматериала. Для серологического исследования в лабораторию направляют сыворотки крови от норок, для патоморфологического исследования – кусочки внутренних органов. Патматериал направляют в термосе со льдом.

Диагноз на алеутскую болезнь норок устанавливают на основании:

-обнаружения характерных гистологических изменений во внутренних органах (посмертная диагностика);

-выявления повышенного количества гамма-глобулинов и специфических антител в сыворотке крови больных норок (серодиаг-

ностика).

Гистологическое исследование основано на обнаружении диффузного плазмоцитоза во внутренних органах. При этом обнаруживают обширные клеточные пролифераты, состоящие из плазматических клеток, по ходу кровеносных сосудов, вокруг канальцев и клубочков почек; по ходу внутридольковых капилляров печени; красной пульпы селезенки; синусах лимфатических узлов.

Серологическая диагностика включает специфические реакции для обнаружения специфических антител в сыворотке крови, а также неспецифические методы для выявления повышенного содержания гамма-глобулинов в сыворотке крови.

Наиболее широко распространенным из неспецифических методов является йодагглютинационный тест (ЙАТ), основанный на свойстве йода осаждать гамма-глобулины при повышенном их количестве в сыворотке крови. Недостатком метода является невысокая чувствительность (40-60% инфицированных животных), а также отсутствие возможности выявлять зараженных норок в бессимптомный период.

Для постановки теста на обезжиренное стекло наносят одну каплю сыворотки крови и добавляют равное количество йодного реактива. Реакцию учитывают через 2 минуты. Положительный результат характеризуется образованием темно-коричневых хлопьев различной интенсивности. Йодный реактив готовят за сутки до исследования по следующей прописи: йода кристаллического 2 г, калия йодистого 4 г, дистиллированной воды 30 мл.

Тимоловая проба также является неспецифическим тестом, основанным на выявлении нарушения физико-химического состояния коллоидных растворов вследствие поражения печени. В тимоловом буфере белки выпадают в осадок и вызывают помутнение раствора. Результаты теста выражают в

62

Лабораторная диагностика ящура может проводиться в двух направлениях: выделение и идентификация вируса (ранняя диагностика) или обнаружение специфических антител у животных-реконвалесцентов (ретроспективная диагностика). Первое направление лабораторной диагностики проводят в случае первичного появления ящура среди поголовья с обязательной типовой и вариантной идентификацией вируса.

Отбор патматериала. Для исследования отбирают патматериал в виде стенок невскрывшихся афт от 2-3 больных животных в количестве не менее 5-10 г. У крупного рогатого скота отбирают афты с языка, у свиней – с пяточка или вымени, у мелкого рогатого скота – с беззубого края верхней челюсти, кожи межкопытной щели и венчика. При отсутствии афт берут кровь во время лихорадки. От трупов молодняка отбирают лимфоузлы головы, поджелудочную железу и миокард.

Подготовка материала. Поступивший в лабораторию материал разделяют на две части: одну используют для постановки РСК, а вторую хранят при минус 20ºС для дальнейшего исследования на случай получения отрицательного результата реакции.

Подготовка материала включает измельчение и гомогенизацию со стерильным нейтральным стеклом и двойным количеством изотонического раствора (33%-ная суспензия). Эту суспензию экстрагируют 2 часа при комнатной температуре, затем промораживают при минус 20ºС в течение 5-18 часов. После размораживания центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30 или 15 минут соответственно. Надосадочную жидкость разделяют на две части: большую часть инактивируют при 58ºС в течение 40 минут и используют в РСК, другую (1-2 мл) после добавления антибиотиков используют для биопробы.

Полученный вируссодержащий материал используют для постановки РСК или РДСК для идентификации вируса ящура, а также определения его типовой и вариантной принадлежности.

Постановка биопробы. При получении отрицательных и сомнительных результатов РСК ставят биопробу или проводят заражение культуры клеток. Для этого могут быть использованы мыши, морские свинки. Биопроба на мышах заключается в заражении 4-6-ти дневных мышей-сосунов по 0,1 мл подкожно или внутрибрюшинно. Положительный результат биопробы характеризуется появлением парезов и параличей с гибелью на 2-5-й день после заражения.

Биопроба на морских свинках заключается в заражении не менее 5 лабораторных животных внутрикожно в плантарную поверхность задних лапок методом туннелирования в дозе 0,2-0,5 мл. После появления первичных поражений на 2-5-й день животное убивают. Генерализованная инфекция у морских свинок наступает только при заражении адаптированными к ним штаммами вируса.

Выделение вируса на культурах клеток осуществляют путем заражения клеточного монослоя первично-трипсинизированных культур почки свиньи или телят. Вирус ящура вызывает развитие характерного ЦПД в виде деструкции. Во всех случаях положительной биопробы или появления ЦПД в культурах клеток наличие вируса ящура должно быть подтверждено в РСК с его вариантной типизацией.

7

Идентификацию выделенного вируса ящура проводят с помощью РСК, при этом учитывают реакцию по 100%-ному гемолизу. При отрицательном результате РСК (что может быть обусловлено малым количеством антигена) можно ставить РДСК с удвоенным количеством типовых сывороток и 2-3 усл. ед. комплемента или РСК с повышенным количеством антигена и активности комплемента и сывороток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Материалом для ис-

следования служат сыворотки крови подозреваемых животных. Отбирают кровь от таких животных не ранее, чем через семь дней после появления клинической картины или вакцинации. Направляют не менее 5-10 проб сывороток крови от каждой возрастной группы. Выявление антител в сыворотках крови может проводиться в обычных ветеринарных лабораториях и не требует создания строгих санитарных режимов исследования. Наличие специфических антител определяют вышеуказанными реакциями, а также дополнительно НРИФ, а также реакцией серозащиты на мышах-сосунах.

Бешенство животных – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. К вирусу болезни восприимчивы все виды животных, а также человек.

В развитии клинической формы болезни различают три периода: продромальный, период возбуждения и параличей. Продромальная стадия характеризуется повышением чувствительности животного к внешним раздражителям (шум, свет, прикосновение). Стадии возбуждения свойственны приступы буйства и ярости, а также судороги. В период параличей у животного снижается или вовсе исчезает болевая чувствительность, развиваются параличи, нарушается деятельность центров кровообращения и дыхания.

Кроме того, у многих животных бешенство может протекать в буйной форме с преобладанием процессов возбуждения или в тихой форме с преобладанием процессов угнетения. Случаи выздоровления при бешенстве редки.

Возбудителем бешенства является вирус из семейства Rhabdoviridae рода Lyssavirus, представляющий РНК-геномный вирус с единой односпиральной линейной молекулой РНК. В зрелом вирионе содержится несколько групп белков, наиболее важными из которых являются белки, обозначаемые как белки N, M, G. Белок N непосредственно связан с РНК вируса, формируя в комплексе с нуклеиновой кислотой рибонуклеопротеид (РНП). Этот белок индуцирует образование комплементсвязывающих антител в организме зараженного животного, однако эти антитела не защищают животное от заражения. Белок М содержится в капсиде вируса и участвует в упаковке РНП в виде спирали. Суперкапсид всех рабдовирусов содержит наружный белок G, имеющий гликопротеиновую природу. Поверхностный белок G вызывает формирование вируснейтрализующих антител в организме зараженного животного, которые играют главную роль в защите от инфекции.

До настоящего времени установлено 7 генетических линий в роде Lyssavirus, разделенных на 4 серотипа вируса бешенства, что обусловлено различием в составе мембранного белка, однако в ветеринарной практике серотипизацию выделенных вирусов проводят редко, так как большинство вирусов, изоли-

8

ется у норок без генетической предрасположенности, а также зараженных вертикальным путем от инфицированных матерей. Эта форма отличается невысокой летальностью и непостоянным наличием клинических и патологоанатомических изменений. Обычно через один год после заражения непрогрессирующая форма переходит в прогрессирующую.

Прогрессирующая стадия болезни характеризуется специфическим симптомокомплексом болезни. Первоначальными признаками болезни является снижение привеса, исхудание, затем отмечают кровотечения из ротовой полости, развитие анемии, менингита, парезы и параличи. Смертность при этой форме достигает 70-80%. У животных всегда отмечают изменения в почках, печени, лимфоузлах, селезенке, а также геморрагический диатез во внутренних органах. Возбудителем алеутской болезни норок является вирус из семейства Parvoviridae, рода Parvovirus. Возбудитель относится к группе автономных дефектных парвовирусов и содержит однонитевую молекулу ДНК. Как и все парвовирусы, вирус алеутской болезни норок является чрезвычайно устойчивым во внешней среде как вне клеток патматериала, так и в нем.

Внутри организма вирус находится в связанном с клеткой состоянии, а также вне клетки. Внутри клетки-мишени, в качестве которой могут быть клетки периферической крови, селезенки, тимуса, лимфоузлов и костного мозга, вирус связан с клеточными ядрами и различными органеллами, в частности рибосомами. Установлена способность к длительной персистенции внутри организма вследствие интеграции генома вируса с геномом клетки хозяина. Обычно такое состояние соответствует непрогрессирующей бессимптомной форме болезни, которая недоступна для клинической, биохимической (в ЙАТ) и иногда серологической (в РИЭОФ) диагностике. В последующем вирус стимулирует систему лимфоидных клеток к интенсивной пролиферации, в результате чего лимфоциты и плазматические клетки инфильтрируют многие органы и синтезируют повышенное количество иммуноглобулина сначала М, а затем G класса. Специфические антитела связываются с вирусом и присоединяют фракцию комплемента (С3), в результате чего образуется комплекс антиген-антитело-комплемент. Однако в образованных комплексах вирус сохраняет свою инфекционность и после поглощения комплекса макрофагами высвобождается и проходит дальнейшую репликацию. Кроме того, нефагоцитированные комплексы, присутствующие в крови в больших количествах, оседают в сосудах кровеносной системы, печени, почечных канальцах, обусловливая развитие характерного симптомокомплекса. Данный этап в патогенезе соответствует прогрессирующей стадии болезни, длительность которого различна. Однако в любом случае характер течения обычно хронический с появлением клинических признаков незадолго до смерти.

В составе вириона обнаружено несколько белков, некоторые из которых являются антигенами, но в патогенезе болезни также определенную роль играют антитела к ДНК вируса. Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства у вируса не установлены. Антигенной вариабельности и родства с другими вирусами не обнаружено. Хотя аналогичное заболевание регистрируется также у хорьков, штаммы вируса алеутской болезни норок и хорьков биологически различны.

Лабораторная диагностика. Диагноз на алеутскую болезнь норок ставят

61

ровых бляшек и миокарда.

Отбор и подготовка материала. В лабораторию направляют от больных животных пробы фекалий, взятые в первые дни болезни, и сыворотку крови для серологической диагностики. От погибших животных отбирают сердечную мышцу и тонкий кишечник. Материал отправляют в термосе со льдом.

Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции собак может проводиться по следующим направлениям:

-обнаружение гемагглютинирующего вируса в патматериале с последующей идентификацией вируса в РТГА или ИФА;

-обнаружение специфических антител в сыворотке крови собак.

Обнаружение вируса в патматериале постановки РГА. С этой целью из

проб фекалий, отобранных в первые четыре дня болезни, готовят на забуференном физиологическом растворе 20%-ную суспензию, после чего ее центрифугируют при 3-5 тыс. об/мин (при возможности 8-10 тыс. об/мин). Образовавшуюся надосадочную жидкость используют в РГА. Реакцию гемагглютинации проводят при 2-4ºС с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов свиней. Учет реакции проводят через 1-1,5 часа. При наличии гемагглютинирующего вируса в материале проводят его идентификацию.

Идентификацию вируса в патматериале проводят при помощи РТГА или ИФА. Постановку РТГА осуществляют общепринятыми методом микро- и макровариантов с 4-8 ГАЕ вируса при 4ºС. Используемые в реакции иммунные сыворотки инактивируют 1 час при 56ºС, после чего их обрабатывают эритроцитами свиней и раствором каолина. При отсутствии гемагглютинации с разведениями вируса 1:8 и 1:16 результат считают положительным

Для постановки ИФА используют кошачьи антитела к вирусу панлейкопении кошек.

Серодиагностику парвовирусной инфекции собак осуществляют в РТГА, где в качестве антигена используют штамм вируса SP-80, получаемый в культуре легочных клеток кошек. В реакции используют эритроциты свиней, фиксированные 3%-ным раствором формальдегида. Исследуемую сыворотку инактивируют прогреванием при 56ºС в течение 30 минут и адсорбируют свиными эритроцитами с целью удаления неспецифических агглютининов. Сыворотки считают положительными при наличии специфических антител в разведении 1:160 и выше.

Алеутская болезнь норок (плазмоцитоз норок) – контагиозная, медленно развивающаяся инфекционная болезнь, характеризующаяся распространенной плазмоклеточной пролиферацией (плазмоцитозом), гипергаммаглобулинемией, явлениями геморрагического диатеза, анемией и прогрессирующим истощением зверей.

К болезни восприимчивы норки всех пород, независимо от пола и возраста, однако животные определенных пород (алеутские, сапфировые, голубые) генетически предрасположены к более тяжелому проявлению болезни. Как было установлено, они являются гомозиготными носителями рецессивного гена аа. Болезнь протекает остро, подостро, хронически (чаще) и латентно. Различают бессимптомное развитие болезни (непрогрессирующая форма), которое развива-

60

руемых при клинических случаях болезни, относятся к одному сероварианту (классический вирус бешенства, генотип 1, серотип 1). Все остальные лиссавирусы, хотя и вызывают болезнь со сходными с классическим бешенством клиническими признаками, большого эпизоотологического значения не имеют.

Вирус выделяется со слюной инфицированного животного за 10 дней до появления первых клинических признаков, поэтому все покусавшие животные должны быть изолированы на срок 15 дней под наблюдением ветеринарного врача. При появлении характерной клинической картины диагноз на бешенство может быть установлен только лабораторным путем.

Отбор и подготовка материала. В лабораторию для исследования направляют свежие трупы мелких животных, от крупных – голову или головной мозг. Труп или голова должны быть тщательно упакованы в целлофановый пакет, мозг – в банку с резиновой пробкой, залитой парафином. Консервирование материала в 50%-ном глицерине нежелательно, так как в этом случае невозможно проведение достоверного серологического исследования. Вскрытие трупа и отбор патматериала следует проводить в условиях стерильности при строжайшем соблюдении мер личной профилактики: руки защищают двумя парами перчаток – хирургических и анатомических, для защиты глаз надевают очки, а на нос и рот - шестислойную марлевую повязку. Кроме того, ветеринарный персонал должен быть предварительно вакцинирован против бешенства.

Лабораторная диагностика бешенства включает:

-обнаружение специфических телец-включений Бабеша-Негри при гистологическом исследовании;

-выявление вирусного антигена в реакции иммунофлуоресценции;

-выявление вирусного антигена в реакции иммунодиффузии;

-постановку биопробы на белых мышах.

Обнаружение специфических телец-включений проводят после окраски зафиксированных препаратов из левой и правой сторон головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, кора полушарий, продолговатый мозг) по Селлерсу или Муромцеву. При этом тельца Бабеша-Негри по окраске по Селлерсу выглядят как четко очерченные овальные или продолговатые гранулярные образования розовокрасного цвета в цитоплазме, при окраске по Муромцеву – в виде темно-синих гранулярных образований, чаще расположенных вне нервных клеток.

Постановка РИФ. Одновременно с исследованием на обнаружение телецвключений вторую часть мазков исследуют в реакции иммунофлуоресценции. В диагностической практике проводят прямой метод РИФ с применением антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина. Фиксацию препарата осуществляют в охлажденном (8-10ºС) ацетоне на срок не менее 4 часов. Антиген вируса бешенства выявляется в виде ярких желто-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины в клетках или (чаще) вне клеток. Диагноз на бешенство считается установленным при обнаружении в нескольких полях зрения достаточного количества (не менее 10) типичных гранул с характерным свечением или множества мельчайших точек. В случае получения отрицательных результатов гистологического и серологического (в РИФ) исследований проводят постановку РИД с целью выявления антигена и постановку биопробы.

9

Постановку РИД проводят микрометодом на предметных стеклах, используя 1-1,5%-ный агаровый гель по общепринятой методике. Антигеном для реакции служат измельченные пинцетом в гомогенную пастообразную массу кусочки головного мозга. При этом антиген помещают в 4 раздельные центральные лунки: материал с аммоновых рогов, коры полушарий, мозжечка и продолговатого мозга. При получении отрицательного результата окончательный диагноз ставят по результатам биопробы.

Биопробу проводят на 6-10 молодых мышатах массой 16-20 г или мышатах-сосунах массой 6-8 г, причем последние являются более чувствительными к вирусу. Перед постановкой биопробы из оставшегося материала готовят 10-%-ную суспензию по общепринятой методике. Половину из используемых в эксперименте мышей заражают интрацеребрально в дозе 0,015 – 0,03 мл, а остальных – подкожно в верхнюю губу в дозе 0,1-0,2 мл. Ежедневное наблюдение за мышами ведут в течение 30 дней, причем гибель в первые 48 часов после заражения не учитывается.

Экспериментальная инфекция у мышей характеризуется появлением симптомов, включающих взъерошенность шерсти, горбатость спины, нарушение координации движения, параличи задних, а затем и передних конечностей, после чего наступает гибель животного. У павших животных исследуют головной мозг на наличие телец Бабеша-Негри, в РИД и РИФ. По результатам биопробы ставят окончательный диагноз.

Ретроспективную серодиагностику бешенства не применяют вследствие значительной сероконверсии вируса и высокой смертностью больных животных, а характер изменения титра антител исследуют только для оценки поствакцинального иммунитета. В мировой практике при осуществлении международной торговли животными проводят диагностику инфекции реакцией нейтрализации в культуре клеток или твердофазным ИФА.

ЛЕКЦИЯ 2. ВИРУСЫ ГРИППА, ПАРАГРИППА-3, ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА

Грипп животных - высококонтагиозная остро протекающая болезнь, характеризующаяся внезапным началом, резко выраженной лихорадкой, конъюнктивитом, поражением дыхательной системы (прежде всего верхних дыхательных путей), при более тяжелом течении – пневмонией.

Грипп кур (классическая чума птиц) – острая контагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся общим угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения.

Все вирусы гриппа относят к семейству Orthomyxoviridae, включающему три рода – род вирусов гриппа А, В и С. Возбудителем гриппа животных является исключительно род А. Возбудитель гриппа представляет собой РНК-геномный вирус, содержащий минус-нить РНК. Вирион является сложным комплексом антигенов, которые по локализации делят на внутренние и наружные. Вирусы гриппа А содержат общий внутренний антиген, отличающийся в антигенном отношении от такового у других родов. Внутрен-

10

Выделяют три формы болезни: сердечная (у собак 3-8-недельного возраста), кишечная (с 8-недельного до 9-месячного возраста), а также комбинированная (6-16-недельного возраста). Развитие того или иного синдрома обусловлено необходимостью размножения возбудителя только в активно делящихся клетках, поражение органов зависит от возраста животного. Возбудителем парвовирусной инфекции собак является вирус из семейства Parvoviridae, рода Parvovirus. Данный род также включает возбудителей панлейкопении кошек, алеутской болезни норок, энтерита норок, парвовирусы свиней, крупного рогатого скота и других животных.

Общим свойством всех вирусов семейства Parvoviridae является наличие односпиральной линейной молекулы ДНК. Данное семейство включает автономные (недефектные) вирусы, требующие для своей репликации только чувствительную клетку, а также дефектные вирусы, которые требуют присутствия вирусапомощника, чаще аденовируса или герпесвируса. К автономным вирусам относят все вирусы родов Parvovirus и Erythrovirus. Все дефектные вирусы объединены в род Dependovirus.

Вирионы парвовирусной инфекции собак представляют собой безоболочечные частицы с кубической симметрией, капсид которых состоит из 32 капсомеров. Парвовирусы являются самыми мелкими вирусами животных и имеют размер 18-26 нм. Вирион представляет собой односпиральную линейную молекулу ДНК, окруженную белковым капсидом. У всех штаммов имеются три типа полипептидов, обозначаемых как VP67, VP70, VP85. Присутствие липидов, углеводов и ферментов в составе вирионов не обнаружено. Простое химическое строение придает вирусу большую устойчивость во внешней среде как к температурным фактору – устойчив в течение 1 часа при 60ºС, так и химическому воздействию. Данное свойство обусловливает постоянное присутствие вирусов во внешней среде и контаминацию биологических препаратов.

Вантигеном отношении парвовирусы собак родственны парвовирусам энтерита норок и панлейкопении кошек, поэтому они объединены в одну серологическую подгруппу парвовирусов.

Парвовирусы способны размножаться только в высоко активных, интенсивно пролиферирующих клетках, поэтому культивирование возбудителя в пер- вично-трипсинизированных клетках неэффективно. С этой целью используют перевиваемые линии, наиболее высокочувствительными из которых является культура клеток А-72, получаемая из подкожной опухоли собак. Однако реплицирующийся вирус развитие ЦПД в культуре клеток не вызывает, а его присутствие обнаруживается только по результатам РИФ.

Вирус обладает гемагглютинирующей активностью к эритроцитам многих видов животных, однако наиболее часто с этой целью используют эритроциты свиней. Все парвовирусы собак по гемагглютинирующей активности могут быть разделены на две подгруппы: штаммы первой подгруппы агглютинируют эритроциты в широких температурных диапазонах – от 4ºС до 37ºС, а второй подгруппы – только при 4ºС. В этой связи постановку реакции с парвовирусами собак рекомендуется проводить при низкой температуре – 2-4ºС.

Ворганизме зараженного животного вирус репродуцируется в клетках эпителия кишечника, лимфоидной ткани миндалин, лимфоузлов, селезенки, пейе-

59