Безклітинні білоксинтезуючі системи (ббсс)

Безклітинні білоксинтезуючі системи використовуються для вивчення матричної активності іРНК і аналізу поліпептидів, які з них транслюються. До їх складу входять: рибосоми, матриця (штучна або природна РНК), білкові фактори трансляції, аміноацил тРНК, АТФ, одновалентні і двохвалентні катіони (K, Ca), буферний розчин для підтримки гомеостазу, амінокислоти. В генній інженерії безклітиннібілоксинтезуючі системи використовуються для дослідження кодуючого потенціалу і механізмів експресії клонованих генів in vitro, і на проміжних етапах конструювання рекомбінантних генів для ідентифікації мРНК або фрагментів ДНК по кодованим білкам.

За походженням компонентів без клітинні білоксинтезуючі системи можна класифікувати як прокаріотичні та еукаріотичні. Найбільш поширені прокаріотичні білоксинтезуючі системи – на основі екстрактів з кишкової палички (E.coli). З еукаріотичних білоксинтезуючих систем для трансляції матриць еукаріот застосовують 2 основні системи: з ретикулоцитів кролика та із зародків пшениці. Ці системи являються універсальними, в них можна транслювати будь-які матриці.

Для проведення аналізу готують реакційну суміш, яка складається з ретикулоцитного лізату або екстракту зародків і суміші амінокислот, мічених амінокислот, АТФ, буферу, матричної РНК та інших компонентів. Суміш інкубують, після чого перевіряють включення мітки у наново синтезовані білки (за радіоактивністю) і тестують білки за допомогою електрофорезу.

Трансляція in vitro корисна при уточненні ролі окремих компонентів системи синтезу білка, так як їх можна видаляти і додавати по мірі необхідності. Її використання допомагає при розшифруванні генетичного коду. В деяких безклітинних системах транслюють попередньо очищену мРНК або використовують ендогенну мРНК, яка присутня в полісомах. В інших білок синтезуючих системах – системах спряженої транскрипції і трансляції, – синтез мРНК і її трансляція рибосомами йдуть одночасно. В якості матричної РНК також використовуються штучні полінуклеотиди відомого складу. В даний час механізми трансляції in vitro застосовуються і для визначення механізмів розподілу білка по різним внутрішнім компартаментам.

Лекція № 10. Біотехнологія одержання культури тваринних клітин і тканин

1. Культивування клітин. Історія методу.

2. Введення клітин у культуру, їхнє походження.

3. Характеристика клітин, які культивуються in vitro.

4. Поживні умови культивування.

5. Системи культивування клітин.

6. Використання культури клітин людини.

7. Культивування клітин і тканин безхребетних.

8. Культивування органів.

9. Гібридизація тваринних клітин. Історія методу.

10. Методи створення експериментальних химер.

11. Механізм злиття клітин.

12. Моноклональні антитіла.

13. Функціональна структура антитіл.

14. Одержання моноклональних антитіл.

15. Методи аналізу на основі моноклональних антитіл.

16. Застосування моноклональних антитіл.

17. Клонування тварин. Історія клонування.

18. Методи трансплантації ядер.

19. Клонування ссавців.

20. Регулювання відтворення сільськогосподарських тварин.