- •Лекція № 1. Основні напрями розвитку біотехнології
- •Біоенергетика
- •Біотехнологія обробки стоків і контроль забруднення води важкими металами
- •Сільськогосподарська біотехнологія
- •Біогеотехнологія
- •Біоелектроніка
- •Біотехнологія в медицині
- •Біотехнології в харчовій промисловості
- •Біотехнологія молочних продуктів
- •Виробництво спиртів і поліолів
- •Виробництво вторинних метаболітів
- •Біотрансформація
- •Виробництво ферментів
- •Виробництво амінокислот, органічних кислот, вітамінів
- •Біоконверсія лігноцелюлозних об'єктів
- •Використання грибів у біотехнології
- •Найпростіші в біотехнології
- •Водорості
- •Рослини в біотехнології
- •Стадії біотехнологічного виробництва
- •Технологія виготовлення поживного середовища для біосинтезу
- •Підтримка чистоти культури
- •Ферментація, будова ферментера
- •Загальні принципи розділення речовин
- •Одержання готових товарних форм препаратів
- •Субстрати для культивування мікроорганізмів з метою одержання білка
- •Лекція № 6. Технологія одержання мікробних ліпідів
- •Мікроорганізми – продуценти ліпідів
- •Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів
- •Глибинний метод виробництва ферментів
- •Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
- •Іммобілізація ферментів
- •Класифікація носіїв для ферментів
- •Методи іммобілізації ферментів
- •Застосування іммобілізованих ферментів
- •Іммобілізація клітин
- •Ентомопатогенні препарати грибів
- •Вірусні ентомопатогенні препарати
- •Бактеріальні добрива на основі бульбочкових бактерій
- •Виробництво азотобактерину
- •Бактеріальне добриво фосфобактерин
- •Антибіотики для сільського господарства
- •Лекція № 9. Культура клітин рослин
- •Сфери застосування культур рослинних клітин
- •Культури клітин вищих рослин. Історія методу
- •Морфофізіологічні характеристика каллусних тканин
- •Фактори, що впливають на морфогенез in vitro
- •Генетичні механізми, що обумовлюють диференціювання клітин у культурі
- •Суспензійні культури
- •Методики культивування одиночних рослинних клітин
- •Необхідність іммобілізації рослинних клітин, методи
- •Фізіологічні основи переваги іммобілізованих рослинних клітин перед традиційними способами культивування
- •1. Клітини, іммобілізовані в або на інертному субстраті, утворюють біомасу набагато повільніше, ніж зростаючі в рідких суспензійних культурах.
- •2. Крім повільного росту іммобілізація клітин дозволяє їм рости в тісному фізичному контакті одине з одним, що сприятливо позначається на хімічних контактах.
- •Системи культивування іммобілізованих клітин
- •Застосування ізольованих протопластів
- •Способи отримання і культивування протопластів
- •Способи культивування протопластів
- •Злиття протопластів (парасексуальная гібридизація)
- •Види соматичних гібридів
- •Конструювання клітин
- •Клітинна селекція. Методи клітинної селекції
- •Генетичні основи застосування культури клітин в селекційних цілях
- •Типи клітинних культур, які використовуються в селекції
- •Переваги клітинної селекції перед традиційними селекційними методами
- •Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин
- •Фактори, впливають на процес клонального мікророзмноження
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Методи клонального мікророзмноження
- •Оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів методами хіміотерапії і термотерапії
- •Створення штучних асоціацій клітин вищих рослин
- •Підвищення продуктивності сільськогосподарських рослин
- •Ендосимбіотичні асоціації
- •Екзосимбіотичні асоціації з водоростями, грибами, азотфіксаторами
- •Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту
- •Безклітинні системи в біотехнології. Мембрани хлоропластів
- •Одержання фотогальванічних елементів з використанням бактеріальних мембран
- •Безклітинні білоксинтезуючі системи (ббсс)
- •Лекція № 10. Біотехнологія одержання культури тваринних клітин і тканин
- •Культивування клітин. Історія методу
- •Введення клітин у культуру, їхнє походження
- •Характеристика клітин, що культивуються in vitro
- •Поживні середовища й умови культивування
- •Системи культивування клітин
- •Використання культури клітин людини
- •Культивування клітин і тканин безхребетних
- •Культивування органів
- •Гібридизація тваринних клітин. Історія методу
- •Методи створення експериментальних химер
- •1. Агрегаційний – був запропонований практично одночасно й незалежно один від одного Тарковським у Варшаві та Мінц у Філадельфії (1961-1962 р.).
- •2. Ін’єкційний – був розроблений р. Гарднером у 1968 р.
- •Механізм злиття клітин
- •Моноклональні антитіла. Функціональна структура антитіл
- •Одержання моноклональних антитіл
- •Методи аналізу: імуноферментний (іфа), імунолюмінесцентний, імунорадіологічний
- •Радіоактивні мітки
- •Застосування моноклональних антитіл
- •Клонування тваринних клітин. Історія клонування
- •Методи трансплантації ядер
- •Клонування ссавців. Історія клонування
- •Регулювання відтворення сільськогосподарських тварин
- •Суперовуляція
- •Аеробне очищення стічних вод
- •Анаеробні системи очищення
- •Показники забруднення стічних вод
- •Перелік питань які виносяться на підсумковий контроль
- •Література
Застосування ізольованих протопластів
Протопласти є унікальною моделлю для вивчення фундаментальних фізіологічних проблем у рослин. Вони незамінні при вивченні складу, структури і функціонування плазмалеми в нормі і при дії на неї гормонами, інгібіторами, фітототксинами, а також при взаємодії самих протопластів в популяції. Крім того, протопласти можуть використовуватися для визначення складу й архітектоніки первинної клітинної стінки та вивчення механізму її репарації після руйнування.
На схемі (рис. 5) представлені основні напрямки фізіологічних досліджень з використанням культури ізольованих протопластів.
Таким чином, ізольовані протопласти мають кілька областей застосування, як теоретичного, так і прикладного характеру:
1. Вивчення хімії та структури клітинної стінки (і при руйнуванні, і при синтезі «de novo»).
2. Вивчення властивостей плазмалеми, трансмембранних переміщень.
3. «М'яке» виділення органел.
4. Спостереження за закономірностями диференціювання клітин при злитті протопластів, відстеження взаємодії ядра і цитоплазми в отриманій гібридній клітині, вивчення соматичних гібридів.
5. Введення чужих органел.
6. Введення чужорідних генів в рослинну клітину (трансгенез).
Способи отримання і культивування протопластів
Виділення протопластів. Протопласт – клітина, позбавлена целюлозної оболонки, оточена цитоплазматичною мембраною, що зберігає всі властивості, притаманні рослинній клітині. Вперше протопласти в 1892 р. виділив Дж. Клеркер, який використовував механічний спосіб. При цьому способі у плазмольованих клітин розрізають клітинну стінку, протопласти виходять в середовище.
В даний час метод зазнав модифікації, поліпшений, але має ряд обмежень: невисока продуктивність; можна використовувати тканини тільки з екстенсивним плазмолізом; трудомісткість і тривалість.
Рис. 5. Ізольовані протопласти – об'єкт і модель у фізіологічних дослідженнях (за Р.Г. Бутенко, 1981)
Інший метод виділення протопластів – ензиматичний, з використанням ферментів. У 1952 році Салтон за допомогою ферменту лізоциму вперше зруйнував клітинну стінку бактерій. У 1960 році Коккінг обробив кінчики коренів томату гідролітичним ферментом з культуральної рідини цвілевих грибів (Myrothecium verrucaria) і вперше отримав ізольовані протопласти вищих рослин ензиматичним способом.
Переваги ензиматичного методу в порівнянні з механічним: одночасно виділяється велика кількість протопластів (до 10 млн. з грама тканини або клітин); клітини не зазнають сильного осмотичного стресу; клітини не ушкоджуються; метод порівняно швидкий.
Для видалення клітинної стінки використовують ферменти трьох типів: целюлази, геміцелюлази і пектинази. Комбінація ферментів та їх співвідношення специфічне для кожного типу клітин.
Виділення протопластів проводять у три етапи:
– обробка ферментами,
– виділення протопластів з клітинних стінок,
– відділення інтактних протопластів від клітинних уламків.
Стандартна методика протопластів (за Такебе) з тканин листа Nicotiana tabacum:
Зрілий сформований листок відокремлюють від дорослої рослини у віці 60 – 80 днів, занурюють у 70% етанол, а потім поміщають на 15 – 20 хвилин в 10% розчин гіпохлориту кальцію і багаторазово промивають дистильованою водою. За допомогою пінцета нижній епідерміс знімають, очищене від епідермісу листя розрізають скальпелем на невеликі шматочки площею 4 см2. Для кращого зняття епідермісу листя повинне трохи зав’яти , можна також обмежити постачання води перед зрізанням листя.
Далі тканину обробляють послідовно або одночасно пектиназою, що викликає мацерацію, і целюлазою, що руйнує клітинні стінки. Оптимальна концентрація ферментів, як і час обробки, індивідуальні для різних тканин. Протопласти повинні знаходитися в розчині ферментів мінімальну кількість часу, після чого слід ретельно їх промити. Ферменти стерилізують через бактеріальні фільтри.
Регулювання водообміну клітини пов'язане з наявністю клітинної стінки. Коли протопласт "голий", один з компонентів регуляції водообміну втрачається, тому важливе значення набувають осмотичні властивості середовища виділення і культивування. Середовище повинне бути трохи гіпертонічним, щоб протопласти перебували в злегка плазмольованому стані. Ці умови гальмують метаболізм і регенерацію клітинної стінки. В якості осмотичних стабілізаторів використовують цукор (глюкозу, маніт, сорбіт, ксилозу), іонні осматики (CaCl2, KCl) в концентрації 0,3 – 0,8 моль/л. Концентрації підбираються індивідуально для кожного рослинного об'єкта.
Зручніше обробляти тканини ферментами в чашці Петрі, яку тримають під кутом 15. Суміш ферментів з протопластами переносять в центрифужні пробірки. Відокремити протопласти від ферментативної суміші можна двома способами: або фільтрація з центрифугуванням, або флотація.
При фільтрації суміш пропускають через фільтри з розмірами пор 40 мкм. На фільтрі при цьому залишаються грудки клітин і їх великі осколки. При подальшому центрифугуванні осідають протопласти, осколки залишаються в супернатанті. При повторному центрифугуванні йде відмивання від ферменту, після чого протопласти переносяться в середовище для культивування.
Метод флотації запропоновано О. Гамборгом з співробітниками в 1981 році, і призначається для ослаблених протопластів. Він заснований на тому, що протопласти мають більш низьку щільність, ніж органели або залишки клітинних стінок. До вихідної суміші додають розчин сахарози і центрифугують при швидкості від 40 – 80 до 350 g. Чисті протопласти плавають, уламки осідають на дно.
Протопласти можна виділяти також із суспензійних і клітинних культур. Краще за все – в пізній стадії логарифмічного росту, коли клітинні стінки легше піддаються руйнуванню, протопласти найбільш життєздатні.
Далі протопласти культивують в тих же умовах, що й клітини. Склад солей може бути дещо змінений. Середовище складається з осмотичного стабілізатора, неорганічних сполук, джерела вуглецю, азоту, вітамінів, фітогормонів. Умови культивування: рН середовища 5,4 – 5,8, температура 22 – 28ºС, невисока освітленість (не більше 2000 лк).