
- •Лекція № 1. Основні напрями розвитку біотехнології
- •Біоенергетика
- •Біотехнологія обробки стоків і контроль забруднення води важкими металами
- •Сільськогосподарська біотехнологія
- •Біогеотехнологія
- •Біоелектроніка
- •Біотехнологія в медицині
- •Біотехнології в харчовій промисловості
- •Біотехнологія молочних продуктів
- •Виробництво спиртів і поліолів
- •Виробництво вторинних метаболітів
- •Біотрансформація
- •Виробництво ферментів
- •Виробництво амінокислот, органічних кислот, вітамінів
- •Біоконверсія лігноцелюлозних об'єктів
- •Використання грибів у біотехнології
- •Найпростіші в біотехнології
- •Водорості
- •Рослини в біотехнології
- •Стадії біотехнологічного виробництва
- •Технологія виготовлення поживного середовища для біосинтезу
- •Підтримка чистоти культури
- •Ферментація, будова ферментера
- •Загальні принципи розділення речовин
- •Одержання готових товарних форм препаратів
- •Субстрати для культивування мікроорганізмів з метою одержання білка
- •Лекція № 6. Технологія одержання мікробних ліпідів
- •Мікроорганізми – продуценти ліпідів
- •Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів
- •Глибинний метод виробництва ферментів
- •Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
- •Іммобілізація ферментів
- •Класифікація носіїв для ферментів
- •Методи іммобілізації ферментів
- •Застосування іммобілізованих ферментів
- •Іммобілізація клітин
- •Ентомопатогенні препарати грибів
- •Вірусні ентомопатогенні препарати
- •Бактеріальні добрива на основі бульбочкових бактерій
- •Виробництво азотобактерину
- •Бактеріальне добриво фосфобактерин
- •Антибіотики для сільського господарства
- •Лекція № 9. Культура клітин рослин
- •Сфери застосування культур рослинних клітин
- •Культури клітин вищих рослин. Історія методу
- •Морфофізіологічні характеристика каллусних тканин
- •Фактори, що впливають на морфогенез in vitro
- •Генетичні механізми, що обумовлюють диференціювання клітин у культурі
- •Суспензійні культури
- •Методики культивування одиночних рослинних клітин
- •Необхідність іммобілізації рослинних клітин, методи
- •Фізіологічні основи переваги іммобілізованих рослинних клітин перед традиційними способами культивування
- •1. Клітини, іммобілізовані в або на інертному субстраті, утворюють біомасу набагато повільніше, ніж зростаючі в рідких суспензійних культурах.
- •2. Крім повільного росту іммобілізація клітин дозволяє їм рости в тісному фізичному контакті одине з одним, що сприятливо позначається на хімічних контактах.
- •Системи культивування іммобілізованих клітин
- •Застосування ізольованих протопластів
- •Способи отримання і культивування протопластів
- •Способи культивування протопластів
- •Злиття протопластів (парасексуальная гібридизація)
- •Види соматичних гібридів
- •Конструювання клітин
- •Клітинна селекція. Методи клітинної селекції
- •Генетичні основи застосування культури клітин в селекційних цілях
- •Типи клітинних культур, які використовуються в селекції
- •Переваги клітинної селекції перед традиційними селекційними методами
- •Мікроклональне розмноження і оздоровлення рослин
- •Фактори, впливають на процес клонального мікророзмноження
- •Етапи мікроклонального розмноження рослин
- •Методи клонального мікророзмноження
- •Оздоровлення посадкового матеріалу від вірусів методами хіміотерапії і термотерапії
- •Створення штучних асоціацій клітин вищих рослин
- •Підвищення продуктивності сільськогосподарських рослин
- •Ендосимбіотичні асоціації
- •Екзосимбіотичні асоціації з водоростями, грибами, азотфіксаторами
- •Методи збереження генофонду. Методика кріоконсервації, способи уповільнення росту
- •Безклітинні системи в біотехнології. Мембрани хлоропластів
- •Одержання фотогальванічних елементів з використанням бактеріальних мембран
- •Безклітинні білоксинтезуючі системи (ббсс)
- •Лекція № 10. Біотехнологія одержання культури тваринних клітин і тканин
- •Культивування клітин. Історія методу
- •Введення клітин у культуру, їхнє походження
- •Характеристика клітин, що культивуються in vitro
- •Поживні середовища й умови культивування
- •Системи культивування клітин
- •Використання культури клітин людини
- •Культивування клітин і тканин безхребетних
- •Культивування органів
- •Гібридизація тваринних клітин. Історія методу
- •Методи створення експериментальних химер
- •1. Агрегаційний – був запропонований практично одночасно й незалежно один від одного Тарковським у Варшаві та Мінц у Філадельфії (1961-1962 р.).
- •2. Ін’єкційний – був розроблений р. Гарднером у 1968 р.
- •Механізм злиття клітин
- •Моноклональні антитіла. Функціональна структура антитіл
- •Одержання моноклональних антитіл
- •Методи аналізу: імуноферментний (іфа), імунолюмінесцентний, імунорадіологічний
- •Радіоактивні мітки
- •Застосування моноклональних антитіл
- •Клонування тваринних клітин. Історія клонування
- •Методи трансплантації ядер
- •Клонування ссавців. Історія клонування
- •Регулювання відтворення сільськогосподарських тварин
- •Суперовуляція
- •Аеробне очищення стічних вод
- •Анаеробні системи очищення
- •Показники забруднення стічних вод
- •Перелік питань які виносяться на підсумковий контроль
- •Література
Глибинний метод виробництва ферментів
У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі Технічно цей метод більш досконалий, ніж поверхневий, тому що легко піддається автоматизації й механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні зазвичай значно нижча, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.
При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як й у будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.
1. Готування поживного середовища залежить від складу компонентів. Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для готування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня забрудненості сторонніми мікроорганізмами об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації й апарати. Повітря очищається до й після аерування. До початку, тому що містить частки пилу органічної й неорганічної природи, після – тому що несе клітини продуцента.
2. Одержання засівного матеріалу. Для засівання поживний матеріал середовища готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій – молода ростуча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу складається в збільшенні маси продуцента в 3 – 4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко росте (до 5 – 20%). Якщо ж відбувається швидке спороутворення – скорочується до 1%.
3. Виробниче культивування. Біосинтез ферментів у глибинній культурі протікає протягом 2 – 4 діб при безперервній подачі повітря й перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах може гальмувати ріст біомаси продуцента, тому часто свіже середовище або деякі його компоненти вводяться у ферментер на стадії активного росту. Температурний оптимум перебуває в інтервалі 22 – 32С. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості метаболітів, що утворилися, і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, що визначає стратегію корекції процесу й автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкраща якість продуктів.
4. Виділення. У міцелії тридобової культури залишається не більше 15% ферментів. Інші виділяються в навколишні клітини або рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють із фільтратів після відділення біомаси.
5. Одержання товарної форми.
Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів
При поверхневому методі культура росте на поверхні твердого зволоженого поживного середовища Міцелій повністю обволікає й досить міцно скріплює тверді частки субстрату, з якого одержує поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинно бути пухким, а шар культури-продуцента невеликим.
Вирощування виробничої культури відбувається в асептичних умовах, але середовище й кювети необхідно стерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування.
Переваги поверхневої культури: значно більша висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрюванні крохмалю 5 кг поверхневої культури заміняють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.
Посівний матеріал може бути трьох видів:
– культура, що виросла на твердому поживному середовищі;
– споровий матеріал;
– міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.
У три етапи одержують і посівну культуру. Спочатку вихідну культуру продуцента висівають на 1 – 1,5 г зволожених стерильних пшеничних висівках у пробірці й вирощують у термостаті до надлишкового спороутворення. Другий етап – аналогічний, але в колбах, третій – у судинах з 500 г середовища.
Основа складу поживного середовища – пшеничні висівки – джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до них можна додавати бурячний гніт, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середовище водяною парою при помішуванні (температура – 105 – 140С, час 60 – 90 хвилин). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають у ростові камери. Культивують протягом 36 – 48 годин.
Ріст ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набрякання конідій й їхнє проростання (температура не нижче 28С), потім ріст міцелію у вигляді пушка сірувато-білого кольору (необхідно виводити надлишкове тепло) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту й розвитку продуцента необхідні аерація й підтримка оптимальної вологості (55 – 70%).
Культура, яка виросла на нерухомому шарі при поверхневому культивуванні представляє корж із набряклих часток середовища, міцно зв'язаних зрослим міцелієм. Масу подрібнюють до гранул 5 мм. Культуру висушують до 10 – 12% вологості при температурах не вище 40С, не більше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді – у шкіряній і спиртовій промисловості. У харчовій й особливо медичній промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Схема очищення зводиться до наступного:
– видалення нерозчинних речовин;
– видалення супутніх розчинних речовин;
– фракціонування (хроматографічними методами).
Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген – вода. При цьому в розчин переходять цукри, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення й очищення завершує сушіння. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6 – 8% вологи, тоді він може в герметичній тарі зберігатися до року без втрати активності.
Стандартизація ферментного препарату – доведення активності ферменту до стандартного, який відповідає вимогам держстандарту. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі – крохмаль, лактоза й ін.
З огляду на величезні перспективи застосування ферментних препаратів у різних галузях промисловості й сільського господарства, медицині, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень у цій області для оптимізації технології й гарантійного одержання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів.