лб-токсикологія / Лаб. роб № біотест росл

Лабораторна робота №

ВИВЧЕННЯ ТОКСИЧНОСТІ ПЕСТИЦИДІВ

Мета:

Прилади та матеріали:

Питання для самоконтролю:

Основні теоретичні відомості

Біотестування залишкової токсичності рослин

Цей метод дозволяє визначити залишки пестицидів і інших токсинів в біологічному матеріалі, воді і ґрунті.

Одним з класичних і найбільш зручних для спостереження об'єктів є плодова муха (дрозофіла). Вона добре розмножується на поживному середовищі, має короткий (9-12 діб) цикл розвитку, що дозволяє легко культивувати її в лабораторних умовах.

Для приготування поживного середовища необхідно: 1 л води, 36 г манної крупи, 40 г ізюму (або інших фруктів), 60 г дріжджів, 6 г агар-агару (або желатину).

Приготування поживного середовища і отримання культури мух здійснюється таким чином:

1. У доведену до кипіння воду вливають розведені дріжджі і додають манної крупи.

2. В отриману суміш додають (безперервно перемішуючи) заздалегідь помитий, нарізаний дрібними шматочками і розтертий у фарфоровій ступці ізюм (для кращого роздрібнення додають небагато цукру-піску).

3. Приготовлений агар-агар (заздалегідь заливають водою і витримують до стану набухання) нагрівають в окремій склянці і поступово доводять до кипіння і потім виливають в склянку, в якій міститься виготовлене поживне середовище (п.1 і п.2), і доводять до готовності, чекаючи повного розчинення в ході кипіння.

4. Надалі цю суміш охолоджують до 75°С, додають 0,1 мл пропіонової кислоти (антисептик) і розливають в пробірки, де вона повністю остигає.

5. На захололу суміш наносять суспензію дріжджів (5 г дріжджів + 50 мл води). Через 24 години в ці пробірки підсаджують мух і закривають (не дуже щільно) ватою, залишаючи в такому стані на 3 доби.

6. Через 3 доби з пробірок видаляють вихідних (маточних) мух, а імаго – дорослі форми нового покоління використовують для подальших експериментів.

Хід експерименту:

100 г "середньої проби" (суміш тканин з декількох рослин) рослин, взятих з земельної ділянки, обробленої пестицидами, розтирають до стану однорідної маси, в яку додають 10 г яблучного пюре і ретельно перемішують

10 г приготовленої вказаним способом рослинної суміші наносять на дно і стінки кожної з експериментальних склянок об'ємом 100 мл.

Потім ці склянки ставлять догори дном на лист фільтрувального, паперу (щоб уникнути їх небажаної герметизації) і підсаджують в них мух одноденного віку.

Контролем служать мухи, які сидять в склянці з яблучним пюре, але без рослинного матеріалу.

Через 1-2 доби підраховують кількість загиблих мух (% від контролю).

Рівень залишкової токсичності досліджуваного рослинного матеріалу орієнтовно визначають в балах за наступною шкалою:

• 1 бал – рослини містять дуже багато пестицидів (всі експериментальні мухи гинуть менш, ніж за 24 години);

• 2 бала – рослини містять багато пестицидів (гине 100% мух);

• 3 бала – рослини містять підвищену кількість пестицидів (гине 70% мух);

• 4 бала – рослини містять маю пестицидів (гине не більше за 30% мух);

- 5 балів – рослини умовно вільні від пестицидів (кількість експериментальних мух не відрізняється від контролю).

Біотестування залишкової токсичності ґрунтів

Цим методом можна діагностувати залишкову токсичність не тільки ґрунтів, але і компостів, осадів стічних вод, що використовуються як добриво та деяких інших субстратів.

В ролі біотесту виступає реакція культурних рослин – метод проростків, який заключається в наступному: пророщують насіння на дослідженому і контрольному (незабрудненому токсинами) субстраті, фіксуючи енергію його проростання, висоту проростків, довжину коріння, суху масу надземної і підземної частин і т.д.

Перевагу віддають тест-культурам, що швидко проростають і є звичними для даного регіону.

Наприклад, в регіонах з дерново-підзолистими ґрунтами для біотестувапня використовують овес і горох, а в регіонах зі степовими ґрунтами - пшеницю, люцерну, боби і квасолю.

Бажано ставити експеримент водночас з фіксуючими (бобові) і це фіксуючими (злакові) азот рослинами.

Класичною тест-культурою вважається огірок.

Неодмінною умовою експерименту є підтримка постійної вогкості досліджуваного субстрату (на рівні 70% від повної його вологоємкості).

Здійснення цієї умови досягається наступним:

• перед закладенням дослідного експерименту субстрат ретельно просушують і зважують;

• підготовлений вказаним способом субстрат зволожують водою у кількості, яка дозволить досягти 70%-ої вогкості;

• зволожений субстрат розносять в експериментальні місткості і визначають їх загальну вагу разом із субстратом.

У ході експерименту зважування періодично повторюють і компенсують втрату вологи шляхом поливу відповідною кількістю води.

Можливі три варіанти експерименту:

1-й – в субстрат вносять різну кількість відомої токсичної речовини;

2-й – порівнюють фітотоксичність ґрунтів, взятих з полях, де застосовувалися пестициди, або субстратів (компости, осади стічних вод і ін.), з ґрунтами, взятими на полях, що не обробляються пестицидами, або в умовно чистих ділянках території того ж регіону;

3-й – грунт, забруднений токсинами, зміщують з умовно чистим (незабрудненим) в зростаючій пропорції – від 1 до 100%.

Всі дослідження проводять не менш, ніж в трьох повторностях.

Хід експерименту:

У кожну експериментальну місткість вносять по 100 г субстрату, зволоженого до 70%, на який висівають по 20 насінь тест-культури.

На четвертій добі місткості з висадженим в них насінням розташовують на полиці, де (по можливості) протягом 14-ти годин – з 6.00 до 20.00 підтримується постійне освітлення. В таких умовах їх витримують протягом ще 2 тижнів, спостерігаючи за наступними показниками:

• час появи сходів і їх кількість (кожну добу);

• загальна кількість пророслого насіння на кінець експерименту. Через 2 тижні, молоді рослини обережно звільняють від ґрунту, ретельно струшуючи з них його частинки. Потім рослини, висушують на повітрі і визначають суху масу сходів.

Результати фіксують або відносно всіх сходів, або перераховують їх на "середню" рослину, а вже потім порівнюють з результатами, отриманими на контрольних (вирощених на "чистому" ґрунті) рослинах.

І при цьому треба звертати увагу і на морфологічні особливості рослин - раннє пожовтіння, особливості розвитку кореневої системи і ін.).

Фітотоксичний ефект може бути визначений у % від маси рослин, кількості пошкоджених рослин або кількості сходів.

Виходячи з кількості утвореної рослинної маси, фітотоксичний ефект (ФЕ) розраховують за формулою:

де М_о – маса одної або всіх рослин в місткості з контрольним ґрунтом; М_х – маса одної або всіх рослин в місткості з досліджуваним ґрунтом.

Визначивши (якщо є можливості) вміст токсичних речовин в пробі ґрунту і виходячи з того, що 20-сантиметровий шар родючого горизонту ґрунту на площі 1 га важить в середньому 3 тис. т., можна шляхом нескладних розрахунків орієнтовно оцінити їх загальну кількість у вказаному шарі ґрунту на всьому полі або на окремій ділянці.

Крім того, за результатами експериментів можна скласти карту, яка наочно продемонструє динаміку токсичності ґрунтів по території регіону.

Біотестування загальної токсичності водного середовища

Цей метод дозволяє контролювати рівень токсичності відкритих водних джерел і стічних вод (перед їх скиданням у водойму).

В якості тест-організму використовується дафнія. Експеримент триває 5 діб при температурі води 17-22°С.

Проби відбирають щодобово або з більш тривалим інтервалом – 3 доби, тиждень, місяць, квартал і т.д. в залежності від мети експерименту.

Критерієм токсичності водного середовища служить стан (поведінка) дафній або їх виживаність, які умовно оцінюють в балах згідно наступної шкали:

• 1 бал – вода надто гостро токсична (100% дафній гине протягом 1 доби або за менший термін часу);

• 2 бала – вода гостро токсична (100% дафній гине протягом 5 діб);

• 3 бала – вода токсична (70% дафній гине протягом 5 діб);

- 4 бала – вода мало токсична (за 5 діб гине не більше 30% експериментальних дафній);

- 5 балів – вода умовно нетоксична (виживає 100% дафній і всі вони на зовнішній вигляд і поведінку не відрізняються від контрольних).

Хід експерименту:

У 10 склянок наливають по 100 мл досліджуваної води. В кожну з них вносять по 1-2 особини дафній (бажано молодих у віці 1-2 доби).

Контролем служать дафнії, яки сидять в склянці з водою (100 мл), взятою з умовно чистої ділянки досліджуваної водойми.

Експеримент дозволяє не тільки встановити токсична вода чи ні, але і вирішити деякі задачі, зокрема:

а) вивчити поширення токсичних компонентів стічних вод по акваторії по мірі видалення їх від місця скиду;

б) встановити у скільки разів повинні розбавлятися стічні води водою водойми, щоб досягнути найменшого рівня токсичності; в цьому випадку проводиться не менше 4 серій експериментів, в кожній з яких визначається загальна токсичність проб стічної води, розбавлених водою з умовно чистих ділянок досліджуваної водойми у співвідношенні 1:5, 1:10, 1:100, 1:500 і т.д. (дана пропорція може бути і більш дрібною – 1:1, 1:2, 1:3 і т.д.); співвідношення, при якому експериментальні дафнії не гинуть (рівень загальної токсичності води 5 балів), вважається оптимальним;

в) оцінити рівень загальної токсичності зливових вод, які надходять у водойму з території міста або з іншого водозбору (поле, шахтні відвали, звалища побутового сміття і ін.); для цього навіску ґрунту добре перемішують із заданим об'ємом дощової води, взятої у співвідношенні 1:10, і настоюють протягом доби (або періодично струшують протягом 1 години, а потім дають відстоятися); після цього пробу фільтрують і аналізують фільтровану воду на загальну токсичність; контролем тут служить вода, взята з умовно чистої ділянки водойми.

Література: