Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
современная генетика т2.doc
Скачиваний:
210
Добавлен:
21.02.2016
Размер:
9.54 Mб
Скачать

Биохимический анализ репликации днк

В клетках E. coli содержатся три различных фермента с ДНК-полимеразной активностью. Среди них наиболее полно изучена представленная в клетке наибольшим числом молекул ДНК-полимераза I (Pol I). Этот фермент способен направлять синтез комплементарной цепи по матричной цепи ДНК при наличии соответствующей комплементарной затравочной цепи со свободной З'-ОН-группой, связанной водородными связями с матричной цепью. Полимеризация происходит в направлении 5'  3' за счет взаимодействия очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата с 3'-ОН группой растущей (затравочной) цепи. Фермент Pol I обладает также 5'  3'-экзонуклеазной активностью, т.е. способен последовательно отщеплять 5'-нуклеотиды от цепи ДНК, связанной с матричной цепью. На рис. 13.7 изображена модель структуры ДНК-полимеразы I с указанием расположения соответствующих функциональных центров. Особые ферментативные свойства ДНК-полимеразы I сделали этот фермент эффективным и весьма распространенным инструментом для изучения нуклеиновых кислот (см. Дополнение 13.1).

Фермент Pol I считали единственной ДНК-полимеразой E. coli до тех пор, пока не была обнаружена мутация (polA), подавляющая эту полимеразную активность (не менее чем на 98%), однако не сказывающаяся существенно на способности мутантного штамма к размножению. Благодаря обнаружению мутантного штамма polA биохимикам удалось идентифицировать и выделить две другие ДНК-полимеразы, Pol II и Pol III, которые в обычных штаммах E. coli вносят небольшой вклад в общую ДНК-полимеразную активность.

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

13. Генетический контроль синтеза ДНК 113

Рис. 13.7. Модель ДНК-полимеразы I, показывающая расположение функциональных центров фермента по отношению к матричной и затравочной цепям ДНК.

Дополнение 13.1. Применение ДНК-полимеразы I

E.coli

ДНК-полимераза I (или Pol I) E. coli находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помощью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5'  3'-экзонуклеазной активностей Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т е получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo Радиоактивные ДНКзонды, полученные с помощью ник-транс-

ляции, могут использоваться при скрининге библиотек рекомбинантных ДНК для обнаружения клонов, содержащих комплементарные последовательности ДНК, или для идентификации соответствующих фрагментов рестрикции ДНК после электрофоретического разделения в геле (см гл 9) В присутствии двухцепочечной ДНК, содержащей одноцепочечный разрыв фосфодиэфирной связи, и меченых дезоксирибонуклеозидтрифосфатов ДНК-полимераза I направляет одновременно включение радиоактивных предшественников в растущую цепь и деградацию немеченой цепи ДНК (рис. 138) Двухцепочечную меченую ДНК затем денатурируют тепловой или щелочной обработкой и получают одноцепочечный зонд