Регуляция экспрессии генов с помощью сайт-специфической рекомбинации

Рассмотренные примеры механизмов генетической регуляции основаны на использовании перечисленных в начале этой главы типов регуляторных элементов - белков-регуляторов, низкомолекулярных эффекторов и регуляторных центров. Однако следует отметить, что этим списком не исчерпываются регуляторные возможности прокариот.

Так, бактерии рода Salmonella обладают жгутиками, используемыми для передвижения. Эти жгутики содержат один основной структурный белок - флагеллин; однако бактерии обладают двумя структурными генами, которые кодируют два иммунологически различных типа флагеллинов. Два соответствующих белка обозначают HI и Н2. Структурные гены этих белков не являются тесно сцепленными. В клетках всегда экспрессируется только какой-либо один из них. Ген Н2 тесно сцеплен и экспрессируется синхронно с геном rН1, продукт которого служит репрессором гена HI. Таким образом, при экспрессии пары H2, rН1 синтезируется только флагеллин Н2, поскольку репрессор rН1 предотвращает экспрессию гена HI. Напротив, при подавлении экспрессии H2 и rН1 происходит синтез флагеллина HI. Явление альтернативной экспрессии

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

200 Экспрессия генетического материала

Рис. 15.24. Доказательство наличия спонтанно инвертируемой последовательности в регуляторной области оперона Н2-rН1. А. Плазмиду, содержащую клонированную регуляторную область оперона, размножают для получения большой популяции плазмидных молекул, которые затем линеаризуют обработкой рестриктазой EcoRI (плазмида содержит единственный сайт для EcoRI). Далее проводят денатурацию ДНК и отжиг. Б. Образовавшиеся гетеродуплексные молекулы ДНК анализируют с помощью электронного микроскопа. Ообразный участок негомологии, обнаруживаемый в составе некоторых гетеродуплексных молекул ДНК, свидетельствует о спонтанной инверсии, имеющей место в ходе роста плазмидной популяции. (По Zieg J. et al., 1977. Science 196, 170.) [Copyright 1977 by the American Association for thé Advancement of Science.]

Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 2. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1988. – 368 с.

15. Регуляция экспрессии генов у прокариот 201

Рис. 15.25. Модель фазовой вариации, основанная на представлении об инверсии нуклеотидной последовательности, содержащей промоторную область оперона Н2-rН1. (По Zieg J. et al, 1977. Science, 196, 170.)

генов H1 и Н2 получило название вариации фаз. В культуре, выращенной из клетки, находившейся в какой-либо одной из двух фаз, всегда обнаруживаются клетки в обеих фазах. Частота перехода клеток из одной фазы в другую для различных штаммов Salmonella варьирует в пределах от 1 на 10⁵ до 1 на 10³ клеток за генерацию. Вариация фаз для бактерий Salmonella, вероятно, является одним из способов избежать иммунологического отторжения в ходе инфекции.

Контроль вариации фаз зависит от состояния промотора, направляющего транскрипцию генов H2 и rН1. Это было показано с помощью клонирования соответствующей регуляторной области на плазмидном векторе с использованием методов, описанных в гл. 9. При выращивании клеток E.coli, содержащих плазмиду со встроенной регуляторной областью, можно получить огромную популяцию идентичных молекул. Плазмидную ДНК очищают и линеаризуют с помощью рестриктазы Eco RI (рис. 15.24). Денатурация и отжиг цепей ДНК приводит к образованию гетеродуплексов, содержащих цепи из различных исходных плазмидных молекул. Некоторые из этих гетеродуплексных молекул содержат негибридизующийся участок протяженностью около 800 п. н. (рис. 15.24). Появление этого участка, как оказалось, вызвано тем, что в некоторых плазмидах произошла переориентация участка протяженностью 800 п. н. Это наблюдение позволило предложить модель механизма вариации фаз, согласно которой промотор генов Н2 и rН1 может находиться в одной из двух ориентации («флип» или «флоп»). В одной из них транскрипция с этого промотора приводит к образованию белков Н2 и rН1. При другой ориентации транскрипции этих генов не происходит (рис. 15.25).

Было показано, что инверсия промоторной области у Salmonella направляется системой сайт-специфической рекомбинации. По обе стороны от инвертируемого участка находятся идентичные противоположно ориентированные сегменты последовательности ДНК по 14 п. н. Наряду с промотором генов Н2 и rН1 этот участок содержит также ген (hin), продукт которого направляет сайт-специфическую рекомбинацию между 14-членными повторами. В результате рекомбинации происходит инверсия всего этого участка ДНК. Фаги Р1 и Ми также кодируют белки сайт-специфической рекомбинации, которые могут направлять инверсию сегментов ДНК в их собственных геномах. Оказалось, что эти белки могут заменить дефектный белок Hin в мутантах Salmonella hin ^-.