Лабораторная работа

Определение увеличения микроскопа и измерение линейных размеров малых объектов.

Приборы и принадлежности:

микроскоп биологический, осветитель, микрометр, миллиметровая линейка, предметное стекло с тонкой проволокой, предметное стекло с волосом, гистологический препарат поперечно-полосатой мышцы, подставка для зарисовки изображения.

Цель работы:

изучить микроскоп, определить увеличение микроскопа и линейный размер малого объекта.

ТЕОРИЯ

Понятия из оптики, используемые в пособии:

1. Линза - прозрачное тело, ограниченное двумя сферическими поверхностями, одна из поверхностей может быть плоской.

2. Тонкая линза - линза толщина которой мала по сравнению с радиусом ее кривизны.

3. Оптическая система - система из нескольких линз.

4. Главная оптическая ось линзы - прямая, проходящая через центры всех ее сферических поверхностей.

5. Главная оптическая ось системы - прямая, на которой лежат центры всех ее сферических поверхностей.

6. Собирающая линза - линза, превращающая падающий на нее пучок параллельных лучей в сходящийся пучок.

7. Оптический центр тонкой линзы - точка, расположенная на главной оптической оси, через которую луч света проходит не меняя своего направления. Обычно совпадает с геометрическим центром линзы.

8. Оптический центр глаза - условная точка модельного глаза, при прохождении через которую луч не меняет своего направления.

9. Главный фокус линзы - точка, в которой пересекаются после преломления лучи, падающие на линзу параллельно ее главной оптической оси. В соответствии с направлением распространения луча различают передний и задний главные фокусы

10. Фокальные плоскости - плоскости, проходящие через главные фокусы линзы перпендикулярно к ее главной оптической оси. Параллельные лучи, падающие на линзу под любым углом к главной оптической оси, пересекаются в фокальной плоскости.

11. Фокусное расстояние - расстояние от оптического центра тонкой линзы до ее главного фокуса.

12. Расстояние наилучшего зрения - наименьшее расстояние от предмета до глаза, при котором глаз дает резкое изображение при минимальном напряжении аккомодации. Для нормального глаза оно составляет 25 см.

13. Угол зрения - угол, образованный лучами, идущими от крайних точек предмета через оптический центр глаза.

14. Иммерсионная система - объектив микроскопа, у которого пространство между первой линзой и рассматриваемым предметом заполнено жидкостью с большим показателем преломления, называемой иммерсионной.

Оптическая система и принцип действия микроскопа

Микроскоп представляет собой комбинацию двух короткофокусных оптических систем - объектива и окуляра.

Фокусное расстояние

объектива - несколько миллиметров,

окуляра - несколько сантиметров.

Схема оптической системы микроскопа и ход лучей в нем показаны на рис.1. Соотношение между фокусными расстояниями и оптической длиной тубуса выбраны условно.

Рис. 1

Объектив и окуляр изображены в виде двух собирающих линз Об и Ок. Малый объект АВ помещается на предметном столике перед объективом на расстоянии чуть большем его фокусного расстояния.

Изображение на рис.1 строилось согласно правилам построения изображения в тонких линзах для наиболее простого случая. Когда объект находится на главной оптической оси. Луч 1 идет из точки В параллельно главной оптической оси ОО₁ и после преломления в объективе проходит через его задний главный фокус F_об. Луч 2 идет из точки В без преломления через оптический центр объектива О. В месте пересечения этих лучей лежит точка В₁ - изображение точки В. Опустим перпендикуляр из этой точки на главную оптическую ось и получим точку А₁ промежуточного изображения А₁В₁.

Таким образом с помощью объектива получаем действительное, увеличенное, обратное промежуточное изображение в плоскости, лежащей обязательно за передним главным фокусом окуляра F_ок.

Аналогично с помощью лучей 1’ и 2’ строим окончательное изображение, создаваемое окуляром. После преломления в окуляре эти лучи образуют расходящийся пучок и поэтому не пересекаются. Продолжим их в обратную сторону, точка пересечения В₂ является мнимым изображением точки В₁, а отрезок А₂В₂ - окончательным изображением объекта АВ, увеличенным, мнимым и обратным относительно объекта, лежащего на расстоянии наилучшего зрения S. Это изображение и рассматривает глаз: расходящийся пучок лучей 1’ и 2’ из окуляра входит в глаз, преломляется его оптической системой и образует на сетчатке действительное изображение. При работе с микроскопом глаз располагается так, чтобы его оптический центр совпадал с задним главным фокусом окуляра Fок. Поэтому расстояние наилучшего зрения условно отмеряют от этой точки.

Увеличение, даваемое микроскопом, показывает, во сколько раз величина изображения объекта больше величины самого объекта (рис.1)

К = А₂В₂ / АВ (1)

Если учесть, что К_об = А₁В₁/AB, а К_ок = А₂В₂/А₁В₁, то получим

К = К_обК_ок (2)

Из подобия треугольников ОСF’_об и А₁В₁F’_об и равенств АВ = ОС, F’_обА₁ получаем

, (3)

а из подобия треугольников С₁О₁F’_ок и А₂В₂F_ок и равенства А₁В₁ = О₁С₁ получаем

(4)

где  - оптическая длина тубуса - расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра; S - расстояние наилучшего зрения; f_об, f_ок - фокусные расстояния объектива и окуляра. После подстановки в выражение (2) формул (3) и (4) получаем

(5)

Увеличение объектива и окуляра указываются на их оправе, например, у объектива: 8,20,40,60; у окуляра: 7x, 10x, 15x.

РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ МИКРОСКОПА

Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различения мелких деталей предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобие изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа: разрешающая способность, предел разрешения и полезное увеличение.

Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.

Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.

Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа. Предел разрешения обуславливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.

Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку, изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.

Рис. 2

Введем понятие апертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив ( Рис. 3а).

Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны ( Рис. 2 и 3б). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.

Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально ( Рис.2 и 3б), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол ₁ - угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U/2. Если же взять решетку с меньшим периодом d’, то угол ’₁ будет больше угла U/2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z. Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k=1: . Заменяя d на Z, а ₁ на U/2, получим (6)

Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей ( Рис.3г) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол ₁ будет равен апертурному углу U. Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид

(7)

а) б) в) г)

1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив.

Рис.3

Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n, который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света будет равна _n =   n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим

или (8)

Таким образом формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0.5U и nsin 0.5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А. Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так : ( 9).

Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметром окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.

Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света.

Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большое количество лучей попадает в объектив.

В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n=1,33), кедровое масло (n=1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140⁰ , то для сухого объектива А=0,94, а для объектива с масляной иммерсией А=1,43. Если при расчете использовать длину волны света  = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.

Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.

Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа. Так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.