SELECTION_last_file

471

простагландину F2α аборти. У отриманих плодів досліджують наявність патології в будові тіла. Таким чином, швидко і точно виявляють наявність чи відсутність рецесивного летального гена і не допускають плідника до широкого використання.

Мутація ВLAD була виявлена у великої рогатої худоби. Виникла вона у бугая Осборндейл Айвенго, її розповсюдженню сприяло широке використання в 50…60 роках видатного плідника К.М. Іванхоє. У США і Німеччині 15% бугаїв чорно-рябої голштинської породи є носіями мутації ВLAD. У фенотипі носіїв цієї мутації в гомозиготному стані вона проявляється у вигляді респіраторних захворювань, діареї, сповільненого росту, виразок у ротовій порожнині, неблискучої, скуйовдженої шерсті. що призводить до їх загибелі в перші місяці постнатального розвитку. Названі симптоми у носіїв мутації в гомозиготному стані не піддаються лікуванню (Глазко В.І. та ін., 2001).

У худоби молочних порід також зустрічаються мутації рецесивного гена DUMPS – недостаток синтезу уридинмонофосфату (у голштинській породі) та цитрулінемія – недостаток аргиніносукцинатсинтетази (у молочної худоби Австралії). У гомозиготному стані рецесивні гени DUMPS та цитрулінемії призводять до загибелі тварин. У першому випадку на ранніх стадіях ембріогенезу (до 40 діб), а у другому в постнатальний період внаслідок порушення синтезу сечовини.

Нині біотехнологічні методи, підгрунтям яких є генетична інженерія, дозволяють виявляти тварин, що в своєму генотипі мають ці мутанті гени в гетерозиготному стані.

Метод трансплантації ембріонів доцільно використовувати у програмах зі створення цінних родин, ліній і типів тварин у товарних стадах, а також для розповсюдження в породі цінних мутантних генів (стійкість до захворювань). Підраховано, що за 10 років шляхом трансплантації можна генетично поліпшити стадо, тоді як за традиційного способу селекції це досягається за 30 років.

472

Метод трансплантації дозволяє збільшити м′ясну продуктивність стад молочного напряму продуктивності за рахунок підсадження ембріонів коровам з нижче середньою молочністю на 7…8 добу після їх штучного осіменіння. У результаті такого способу використовують шанс отримати двоє телят. Наприклад, в Ірландії у такий спосіб отримали 78% двійнят у фінської худоби, проти 2,8% природної двійчатості. Другий шлях збільшення кількості двієнь у стаді полягає в прискореному розмноженні потомків від корів, які систематично їх приносять, використовуючи їх як донорів.

Біотехнологічним методом можна вирішувати важливу для селекції проблему регуляції статі потомства, інтенсифікуючи селекційні процеси в популяції тварин на всіх шляхах передачі спадкової інформації у поколіннях: „батько-син”, „батько-дочка”, „мати-син”, „мати-дочка”.

Підґрунтям спрямованої регуляції статі є її визначення в ембріонів та розділення сперми на Х- і Y- сперміїв. Генетичний механізм формування статі, вироблений у процесі тривалої еволюції, забезпечує розщеплення за статтю в співвідношенні 1:1, що зумовлено набором у каріотипі ссавців гомологічних хромосом ХХ (самки) або гетерогенних ХY-хромосом (самці). Тому уже багато років ведуть роботи із розділення сперміїв на гіносперміїв (несуть Х хромосому) і андросперміїв (мають Y хромосому), враховуючи їх різну масу, розмір та рухливість. Для цього використовують різні методи: центрифугування, седиментацію, електрофорез, фільтрацію, цитофлуорометрію, імунологічні, лазер. Нині одна з англійських фірм уже продає заморожену сперму бугаїв, осіменіння якою корів дозволяє отримувати від них тільки телиць.

Для оцінювання і селекції ембріонів за статтю вже розроблено декілька методів, які мають різну точність визначення. Нині стать ембріонів великої рогатої худоби можна визначити за допомогою таких методів: цитогенетичних (ідентифікація статевого хроматину і аналіз набору статевих хромосом у клітинах трофобласту, ефективність – 60…70%); імунологічних (визначення НYантигенів, маркерів чоловічої статі, ефективність – 85…87%); культивуванням 2…3 бластомерів ембріона (клітини із зародків

473

чоловічої статі інтенсивніше розмножуються, ефективність – 90...95%); використання ДНК-зондів (за наявністю або відсутністю Y- хромосоми визначеної за допомогою специфічного для ДНК Y-хромосоми зонда, ефективність – 100%); використання полімеразної ланцюгової реакції (за допомогою ампліфікації специфічних повторів послідовностей ДНК Y-хромосоми, для чого необхідно лише одну клітину, ефективність – 95,4%).

Науково-практичне вирішення цієї проблеми завдяки розробленим методам дозволяє ефективніше здійснювати важливі селекційні заходи в галузі скотарства:

-одержувати в племінному скотарстві вдвічі більше ремонтних бугайців від найпродуктивніших корів, що підвищить диференціал їх добору за походженням;

-щорічно ставити на перевірку на однаковій кількості випробуваного поголів′я корів удвічі більше ремонтних бугайців, оскільки можна одержувати під час перевірки тільки теличок у молочному або бугайців – у м′ясному скотарстві. Це сприятиме ефективнішому виявленню бугаїв-поліпшувачів і тим самим жорсткішому добору перевірених бугаїв;

-впроваджувати оцінювання за якістю їх потомків високопродуктивних корів-матерів ремонтних бугаїв, оскільки від них отримуватимуть методом трансплантації ембріонів тільки телиць;

-здійснювати жорсткіший добір корів до племядра, зменшеншивши в 1,8…2 рази, за умови одержання від них тільки телиць, що підвищить ефективність селекції шляхом збільшення диференціала добору;

-використовувати спадковість (яйцеклітин) поголів’я корів із надоєм 4000…7000 кг молока у формуванні племінної частини стада, довести до 100% замість 50% без регулювання статі потомків;

-поєднувати в оптимальному варіанті добір первісток за власною продуктивністю й походженням;

474

-збільшувати вдвічі коефіцієнт розмноження популяцій тварин, що дуже важливо для прискореного розмноження видатних родин, ліній, нових породних груп худоби та імпортних порід у репродукторах;

-підвищувати частку корів, призначених для промислового схрещування в товарних стадах до 40% (замість 10%) й одержувати від них тільки бичків для відгодівлі, що дозволить збільшити виробництво яловичини (Петренко І.П., Зубець М.В., Вінничук Д.Т. та ін., 1997).

Для розведення та виведення нових порід або поліпшення аборигенних практикують міжнародний обмін генетичним матеріалом. Використання заморожених ембріонів у селекційних програмах дозволяє значно зменшити ризик завезення інфекційних хвороб та вартість поголів′я, яке закуповують, а також придбати найкращий селекційний матеріал. Так, у 1993…1994 рр. Україна закупила заморожені ембріони абердин-ангуської породи американської селекції. Рівень приживлюваності цих ембріонів у телицьреципієнтів у різних господарствах України в середньому склав 50% (у межах 40…62%). З вирощених телят-трансплантантів були сформовані племінні репродуктори породи.

Отже, імпорт генетично цінних ембріонів для трансплантації в санітарному плані має значні переваги порівняно з племінною худобою. Крім того, оздоровлення молочно-м′ясних стад від таких захворювань, як лейкоз, ящур, бруцельоз особливо важливе для селекційно-племінних ферм, метою яких є збереження генетично цінних тварин.

Пересадження реципієнтам заморожено-відтанувших ембріонів, закуплених у країнах з помірним кліматом, дозволяє організму уже в утробі матері адаптуватися до більш суворих умов довкілля. Так, результати досліджень Мухамедгалієва Ф.М. (1985) показали, що трансплантація ембріонів дозволяє запобігти кліматичному стресу у завезених тварин, шляхом адаптації їх у період ембріогенезу опосередковано через організм реципієнта місцевої породи. Завезені із Ангії лінкольнські барани в південносхідні райони Казахстану давали неякісну сперму і слабо проявляли статеві

475

рефлекси. Трансплантувавши чистопородні ембріони лінкольської породи місцевим грубошерстним і тонкорунно-грубошерстним помісним маткам, отримали баранів–трансплантантів з високою життєздатністю та відмінною відтворною здатністю. Це забезпечило успішне впровадження в життя селекційної програми щодо поліпшення якості вовни овець місцевих порід.

У молочному та м′ясному скотарстві України на підґрунті адаптованих порід та з використанням більш продуктивних імпортних, були виведені та створюються нові породи. Але з іншого боку, породоутворювальний процес призводить до зменшення поголів′я адаптованих та аборигенних порід, втрати цінних генів та генетичних поєднань. Саме тому, на цьому етапі розвитку необхідно приділяти значну увагу збереженню генетичних ресурсів,

оскільки в період розквіту генетичної інженерії на їх базі будуть створені оригінальні генетичні варіанти. Міжнародною спільнотою рекомендовано для кожної породи зберігати заморожену сперму не менше 25 неспоріднених плідників та ембріони від не менше 25 варіантів парувань.

8.2. Отримання ембріонів в умовах in vitro

Нині вважають, що метод трансплантації виправдовує себе економічно, якщо від донора в рік отримано шість телят. Така кількість телят, і навіть рекордні результати, що сягають до 130 трансплантатів у рік не дозволяють повністю використати той генетичний потенціал відтворення, який закладений у яєчниках корів у вигляді тисяч ооцитів. Вирішення цієї проблеми можливо завдяки розробці нової біотехнології, підґрунтям якої є спільне використання нехірургічного методу трансплантації ембріонів, отриманих з ооцитів поза організмом самиці, використовуючи методи культивування та запліднення in vitro.

Підґрунтям методу є відкриття в 1935 році Пінкусом та Ензманом спонтанного відновлення мейозу ооцитів, отриманих із антральних фолікулів і розміщених у середовищі для культивування.

476

Біотехнологічний метод отримання ембріонів поза організмом складається з декількох технологічних науково обґрунтованих способів та способів із отримання після їх пересадження реципієнтам трансплантантів.

Першою технологічною ланкою отримання ембріонів в умовах in vitro є отримання ооцитів із фолікулів яєчника. Для цього використовують різні способи, а саме: аспірацію фолікулярної рідини і ооцитів із фолікулів чи механічне багаторазове розсічення металевим лезом яєчників забитих тварин із наступним промиванням їх середовищем для культивування; аспірацію фолікулярної рідини і ооцитів із антральних фолікулів під час багаторазової лапороскопії; отримання яйцеклітин (тубальні ооцити, або ооцит на стадії метафази ІІ) із яйцепроводів у забитих тварин, або хірургічним методом; трансілюмінація-аспірація яєчників; прижиттєвою пункцією антральних фолікулів яєчника за допомогою ультразвукового трансдуктора (метод ОРU – ovum pick-up). Нині у більшості технологій культивування in vitro ооцитів проводять у ооцит-кумулюсних комплексах (ОКК), після оцінювання їх придатності у синтетичних середовищах (DMEM, 199, Ham F-10, Дюльбекко та ін..) з додаванням енергетичних, поживних та гормональних інгредієнтів до стадії мейозу метафаза ІІ.

Біотехнологія отримання зародків поза організмом самиці, підгрунтям якої є отримання незрілих ооцитів із астральних фолікулів яєчників генетично цінних корів методом трансвагінальної пункції під контролем ультразвуку (метод ОРU) двічі на тиждень впродовж 5-и місяців та запліднення і культивування in vitro, дозволяє за 6 місяців отримати в чотири рази більше придатних ембріонів на стадіях морули чи бластоцисти порівняно із вимиванням їх у донорів після суперовуляції. До того ж, метод ОРU не спричиняє патологію відтворної функції корів, про що свідчить їх здатність виношувати плід.

Нині запліднення ооцитів in vitro проведено у 20 видів ссавців. Уперше цим біотехнологічним методом було отримане потомство у 1968 році від мишей, в 1974 р. – від щурів, в 1981 р. – від людини та великої рогатої худоби, в 1983-1984 рр. – від свиней та овець і в 2005 р. – від верблюдів.

477

Ця біотехнологія дозволяє суттєво збільшити потенціал гамет у розрахунку на одну племінну корову та вірогідно і швидко оцінити її генотип, що сприятиме інтенсифікації генетичного прогресу в популяції. Отримання ембріонів в умовах in vitro дозволяє вирішити низку проблем, а саме: отримати ембріони від високопродуктивних донорів, які не реагують або слабо реагують на екзогенні гонадотропні гормони під час суперовуляції, або у них не вдається вимити ембріони; використати генетичний потенціал видатних корів за племінними та продуктивними властивостями після їх вибраковування за віком; створити банки ембріонів та зигот для отримання клонів і трансгенних тварин; збільшити поголів′я молочних стад шляхом підсадження після штучного осіменіння морул та бластоцист низькопродуктивним реципієнтам для виробництва дешевої яловичини.

Крім того, культивування ооцитів, їх запліднення та розвиток зигот в умовах in vitro є підгрунтям впровадження у біотехнологію відтворення сільськогосподарських тварин методів клітинної та генетичної інженерії.

8.3. Клонування

Встановлено, що ядра ембріонів, отриманих в умовах in vitro, можна використовувати для пересадження в яйцеклітини, які дозріли in vitro, з метою отримання клонів.

Статеве розмноження є механізмом підтримки генетичної мінливості в популяції і основа її еволюції. Підґрунтям генетичної мінливості в популяції є виникнення нових комбінацій генів у період дозрівання гамет під час кросинговера, редукційного ділення та розподілення гамет і сингамії пронуклеусів. Водночас ці процеси, забезпечуючи збереження генетичного та фенотипного різноманіття виду, є перешкодою в розмноженні видатних тварин створених копіткою, багаторічною, цілеспрямованою селекційною роботою. Наукові дослідження в селекції та практика використання методу трансплантації ембріонів свідчать, що видатні тварини не передають потомкам нові генетичні комбінації, що спонукало до пошуку та розробки біотехнологічних методів, які б дозволяли отримувати потомків, які є

478

точними генетичними копіями високопродуктивних тварин, тобто їх клонами. Клон (від грецького klon – потомок) – це популяція молекул, клітин, рослин чи тварин, які мають ідентичний генотип і походять від одного предка без статевого розмноження.

Убіотехнології відтворення тварин одним із методів отримання клонів

єрозділення ембріонів. Підґрунтям методу є тотипотентість (здатність розвиватися в будь-якому напрямі) окремих бластомерів та їх конгломератів розвиватися в цілий організм. Такі властивості мають всі ембріони отримані до 8…9-ї доби статевого циклу, включаючи стадії пізньої морули і бластоцисти, що вилупилася.

Вперше однояйцевих близнюків отримав Willadsem S.M. із співавторами в 1979 році шляхом розділення 2-клітинних ембріонів вівці. Подальші дослідження показали, що окремі бластомери із 4- та 8-клітинних ембріонів також здатні розвиватися в бластоцисту, але меншого розміру. І лише менше 10% пересаджених таких бластоцист розвиваються у плід, тоді як „половинки” та „четвертинки” із 2-, 4-, 8- клітинних ембріонів та компактизованих морул і бластоцист, що вилупилися є однаково життєздатними, як і нормальні ембріони.

Нині в багатьох комерційних фірмах, науково-дослідних лабораторіях біотехнології, лабораторіях трансплантації для збільшення кількості ембріонів великої рогатої худоби використовують метод отримання однояйцевих близнюків під час вимивання ембріонів нехірургічним

способом. Ділять як морули (біля 64 клітин), так і бластоцисти (до 256 клітин) на дві і чотири частини, використовуючи мікроманіпулятори, або під бінокулярною лупою, використовуючи як різальний інструмент спеціально підготовлені скляні мікроголки чи лезо для безпечного бриття.

Цей метод майже вдвічі дозволяє збільшити вихід потомків від донора, оскільки половинки мають приживлюваність майже таку, як і нерозділений ембріон. Так, приживлюваність цілих і розділених на половинки ембріонів після хірургічного пересадження в ріг матки на боці яєчника із жовтим тілом

479

становила відповідно 76 та 64 відсотки. Пересаджували ембріони та їх половинки впродовж 6 годин після вимивання.

Іншим методом отримання клонованих тварин на базі сучасних біотехнологій, в обхід традиційних способів відтворення та селекції, є пересадження ядер із соматичних та ембріональних клітин у енуклейовану (видалене ядро) яйцеклітину. Цей метод має велике значення для відтворення та селекції, оскільки практично зумовлює генетичне копіювання тварин, вже оцінених за продуктивними властивостями. Таким чином можна клонувати тварин з цінними генотипами і на їх основі прискореними темпами створювати високопродуктивні лінії та популяції тварин уже із заданою статтю.

У 1952 році американські вчені Р. Брігс і Т. Кінг вперше розробили техніку пересадження ядер соматичних клітин зародка в енуклейовану яйцеклітину, на основі якої показали, що ядра із клітин ранніх ембріонів у стадії пізньої бластоцисти та ранньої гаструли мають тотипотентні властивості, бо забезпечували нормальний розвиток ембріонів жаб. Удосконаливши метод пересаджень ядер, Ж. Гердон у 1961 році вперше в історії науки отримав клони статевозрілих особин африканської шпорової жаби. Всі вони були однієї статі, мали один колір шкіри і один генетичний маркер – безядерну мутацію О-nu.

На основі цієї методики Слєпцова Л.А. із співавторами в 1984 році розробила біотехнологію клонування риб, суть якої полягає в пересадженні ядра соматичної клітини ембріона на стадії бластули в цитоплазму незаплідненої яйцеклітини. Так можна отримувати десятки генетичних копій.

Можливість позитивного результату під час трансплантації ядер у яйцеклітини ссавців підтвердили дослідження, проведені на кролях та мишах, в яких ядра, отримані з 8-клітинного ембріона та морули, пересаджували в незапліднені яйцеклітини, де вони включалися в процес розвитку ембріона до 2...3-х ділень чи навіть до бластоцисти.

480

Ці дослідження спонукали до пошуку нових більш ефективних методів отримання клонів у сільськогосподарських тварин. Тому невдовзі був розроблений метод гібридизації клітин, наслідком якої є утворення ядерноцитоплазматичних гібридів, здатних розвиватися в життєздатний організм.

Метод ґрунтується на пересадженні бластомера ранніх ембріонів, як носія ядра, в енуклейовану яйцеклітину та злитті їх цитоплазм у разі спільного культивування в умовах in vitro. Процес злиття стимулюють різними чинниками, серед яких найбільш поширені інактивований вірус Сендая, поліетиленгліколь, електрозлиття (дія електромагнітного поля). Таким методом уже отримані клони овець, свиней та великої рогатої худоби у багатьох країнах світу, в тому числі і в Україні.

Дослідження із пересадження ядер соматичних клітин дорослих тварин менш успішні. З них розвиваються лише деякі клоновані ембріони, які досить швидко гинуть. Першу сільськогосподарську тварину таким шляхом клонування отримали в 1997 році. Доктор Вільмут із шотландського інституту пересаджував ядра соматичних клітин молочної залози в енуклейовані яйцеклітини. Потім електрозлиттям отримував ядерноцитоплазматичні конструкції, які вирощував у культурі до ранніх стадій ембріонів і трансплантував реципієнтам. У результаті таких пересаджень народилась – всесвітньовідома овечка Доллі.

Слід враховувати, що прогрес у біотехнології відтворення тварин, спрямований на збільшення чисельності потомків видатних тварин, отримання їх методом клонування, може призвести до зменшення генетичної мінливості в популяції і втрати нею цінних генів.

Нині генетична інженерія створює можливість одержання нових генотипів, відкриваючи нові напрями використання біотехнології відтворення в селекції.

8.4. Генетичні химери

Генетичні химери – це організм, що складається із генетично різних клітинних популяцій, які походять від одного чи більше ембріонів.