5. Білки

5.1. Амінокислоти

Біологічні функції білків (каталітична, структурна, механічна, регуляторна, рецепторна, захисна, транспортна, енергетична). -Амінокислоти як мономери білків. Класифікація. Фізико-хімічні властивості. Кислотно-оснóвні властивості амінокислот. Ізойонна- та ізоелектрична точки. Значення для функціонування білкової молекули. Вплив індуктивного ефекту, ефекту поля, резонансного ефекту на дисоціацію амінокислот.

Основні реакції амінокислот в організмі. Реакції амінокислот за a-аміногрупою (нінгідринова, Сенгера з динітрофторбензолом, Едмана з фенілізотіоціанатом,). Кольорові реакції радикалів амінокислот (ксантопротеїнова, Міллона, Фоля). Хроматографічні методи розділення суміші амінокислот. Реакція алкілювання. Утворення бетаїнів. Саркозин, карнітин, ацетилхолін. Метилювання з допомогою сульфонієвих сполук. Аденозилметионін. Значення ферментативного каталізу для перебігу реакцій алкілювання. Алкілювання амінокислот і білків за відсутності ферментів. Специфічність дії алкілюючих агентів. Розробка біохімічних тестів з використанням хімічних методів модифікації біологічних систем. Практика використання дансилхлориду. Ацилювання. Реакції бензоїлювання. Утворення гідантоїнів та тіогідантоїнів. Використання цих реакцій для встановлення амінокислотної послідовності (первинної структури пептидів та білків). Трансамінування. Ферментативні реакції за участю синтетаз та дегідратаз. Переамінування під дією дегідрогеназ. Ізомеризація амінокислот під дією ізомераз. Синтез метіоніну з аспарагінової кислоти. Синтез серину методом гліколізу 3-фосфогліцеринової кислоти. Асиметричний синтез α-амінокислот. Метод Корі. Використання каталізаторів Уілкінсона. Методи блокування аміногруп. Методи блокування карбоксильних груп. Методи активування карбоксильної групи. Шляхи біосинтезу амінокислот з неорганічних речовин. Процеси фіксації азоту у біосистемах. Фіксація вільного азоту. Відновлення нітратів. Включення аміаку до складу органічних сполук.

5.2. Структура білків

Утворення пептидного зв’язку. Хімічний синтез пептидів: методи змішаних ангідридів, активованих етерів, карбодиімідний і карбоксиангідрідний методи конденсації. Блочний, ступінчатий та твердофазний синтез пептидів. Проблема рацемізації. Характеристика електронної будови пептидного зв’язку. Біуретова реакція. Біологічно важливі олігопептиди. Пептидні гормони і рилізинг-фактори. Нейропептиди. Енкефаліни і ендорфіни. Окситоцин і вазопресин. Імуноактивних пептиди. Пептидні токсини і антибіотики. Пеніциліни, цефалоспорини та споріднені антибіотики: клавуланова і оліванова кислоти, тіенаміцин і аспареноміцини, монобактами.

Первинна структура білків. Принципи і значення її визначення. Амінокислотний склад білків. Методи гідролізу білка до амінокислот (кислотний, лужний, ферментативний, на іонообмінних смолах). Селективний гідроліз білка до пептидів. Якісне та кількісне визначення амінокислот у гідролізатах білків. Автоматичний аналізатор амінокислот. Визначення амінокислотної послідовності білка за допомогою рідкофазного, твердофазного і газофазного секвенатора. Історія відкриття амінокислот у білках. Схема встановлення первинної структури білка: визначення N- і С-кінцевих амінокислот; методи Ф. Сенгера, В. Грея та Б. Хартлі, Е.Д. Едмана зідентифікацією фенілтіогідантоїнів та дансиламінокислот, С. Акаборі. Аналіз розташування сульфгідрильних груп та дисульфідних зв’язків.Автоматичний аналізатор послідовності амінокислот у білках та пептидах (протеїн-секвенатор), принцип його дії. Використання мас-спектрометрії при визначенні первинної структури білків. Характеристика первинної структури α- і β ланцюгів інсуліну, α- і β ланцюгів гемоглобіну та інших білків. Первинна структура та видова специфічність білків (на прикладі інсуліну). Зв'язок первинної структури та функцій пептидів та білків на прикладах окситоцину, дериватів гемоглобіну.

Вторинна структура білків, її типи: - спіраль, -структура, колагенова спіраль. Критерії Л. Полінга та Р. Корі. Параметри α- спіралі поліпептидного ланцюга. Сили, які утримують поліпептидний ланцюг в α-конформації. Ступінь спіралізації поліпептидних ланцюгів білків. Зверхвторинна структура. Структура фібрилярних білків на прикладі колагену, еластину і -кератинів. Третинна структура глобулярних білків, домени. Методи визначення трьохмірної структури білку. Конформація поліпептидного ланцюга, конформаційні карти Рамачандрана. Ядерний магнітний резонанс як метод дослідження конформації пептидів і білків в розчинах. Праці Д. Кендрю, М. Перутца та Д. Філліпса по рентгеноструктурному аналізу третинної структури міоглобіну, лізоциму та субодиниць гемоглобіну. Роль водневих, гідрофобних, йонних і ковалентних взаємодій. Типи зв'язків, які забезпечують підтримку третинної структури білкової молекули. Гідрофобні зони ("жирна крапля") у молекулах глобулярних білків. Повна хімічна структура лізоциму та міоглобіну. Орієнтація радикалів амінокислот у цих білках. Динамічність третинної структури білків. Самоорганізація третинної структури білкової молекули; етапи самоорганізації та зв’язок їх з первинною структурою поліпептидного ланцюга. Утворення стабільної трьохмірної структури білків за допомогою шаперонів (білків теплового шоку). Наслідки неправильної укладки білка на прикладі пріонів. Пріони як антишаперони. Гомологічні білки. Четвертинна структура білків. Значення кооперативності субодиниць на прикладі гемоглобіну. Конформаційні зміни білків та їх надмолекулярних комплексів у трансдукції та транспорті речовин (пасивному та активному). Порини та помпи.

Роль іонів d-металів у функціонуванні біологічних систем. Роль іонів цинку у стабілізації білкових молекул. Білки з мотивом «цинкові пальці». Орієнтаційний та концентраційний ефект йонів металів у гідролізі пептидного та естерного зв’язків. Поляризаційні, координаційні ефекти, утворенння активних основних реагентів. Іони феруму у біологічних системах. Гемопротеїни – гемоглобін, міоглобін, цитохроми. Їх роль у транспорті кисню та електронів. Іонна селективність порфіринового кільця. Хімічне моделювання порфіринових структур – переносників кисню. Циклофанпорфірини. Синтез синтетичних гемополімерів. Ферумсульфурпротеїни. Іони міді у біохімічних перетвореннях. Гемоціаніни. Моделювання біметалічних активних центрів. Поняття про Фентон-метали. Іони кобальту у каталізі за участю ціанокобаламіну та інших систем. Метали у формуванні кісткового матриксу. Металопластика та її старіння.

Класифікація білків. Протеїни. Протеїди. Структурно-функціональна характеристика колагену, актину, міозину, імуноглобулінів, міоглобіну, гемоглобіну, цитохромів, транспортних білків біомембран.

5.3. Виділення, аналіз і хімічні модифікації білків.

Фізико-хімічні властивості білків. Методи виділення білків з біологічного матеріалу. Способи гомогенізації матеріалу. Екстракція білків розчинами солей, буферними сумішами, органічними розчинниками, сумішами фенола, оцтової кислоти і води тощо. Методи фракціонування білків: висолювання, осадження органічними розчинниками, осадження солями важких металів, електрофорез, гельфільтрація за допомогою сефадексів, сефарози та біогелей, хроматографія. Способи очищення білкових препаратів від низькомолекулярних домішок: діаліз, електродіаліз, кристалізація, гельфільтрація та ультрафільтрація. Методи визначення гомогенності білкових препаратів.

Молекулярна маса білків. Поняття про хімічне та фізичне значення молекулярної маси білків. Методи визначення молекулярної маси білків: гравітаційний (ультрацентрифугування, віскозиметричний, осмометричний, електрономікроскопічний, рентгеноскопічний, хімічний тощо).

Білки як колоїди. Діаліз, осадження білків. Дегідратуючі речовини на прикладі етанолу і ацетону. Розділення суміші білків за допомогою електрофорезу, розподільчої та іоно-обмінної хроматографії. Вплив умов середовища на стан білків. Явище денатурації, денатуруючі фактори. Дія іонів d-металів на білки. Постсинтетична модифікація білків. Утворення карбонільних похідних, дисульфідів, глікозилювання. Кількісне визначення вмісту цих продуктів.

Методи вивчення трьохмірної структури білків (подвійне променезаломлення у потоці, ультрацентрифугування, електронна мікроскопія, рентгеноструктурний аналіз).

Хімічний синтез білка. Забезпечення оптичної чистоти. Твердофазний синтез білків за Мерріфільдом. Рідкофазний синтез білка. Механізм забезпечення амінокислотної послідовності білкової молекули. Біосинтез олігопептидів. Гомопептиди. Формілювання як метод захисту аміногрупи. Біохімічне зняття захисту. Моделювання структури фармакологічних препаратів, що впливають на білковий синтез. Пуроміцин. Хлорамфенікол. Тетрациклін. Стрептоміцин. Граміцидин S.