5. Строение иммуноглобулинов (Ig). Характеристика основных классов Ig - (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM). Регуляция экспрессии генов Ig и причины их разнообразия.

Все молекулы иммуноглобулинов состоят из 2 идентичных легких (L) цепей (молекулярная масса 23000) и 2 идентичных тяжелых (H) цепей (молекулярная масса 53,000-75,000) связанных в форме тетрамера (L₂H₂) дисульфидными мостиками.

Строение иммуноглобулинов (Ig).

В каждой цепи можно выделить специфические домены, или области, характеризующиеся структурными и функциональными особенностями. Аминокислотная последовательность С-концевого отдела цепи легкой цепи (108-214 аминокислотный остаток) постоянная (константная) –С_L-область. N-концевой отдел легких цепей (1-107 –й аминокислотный остаток) вариабельная (меняющаяся ) V_L-область цепи. Одна четверть тяжелых (H) цепей (около 120 аминокислот) со стороны N -концевой аминокислоты названа переменной (вариабельной) областью (V_H), а остальная часть тяжелой цепи (свыше 300 аминокислот) состоит из нескольких константных областей (C_H1, C_H2, C_H3). N-концевые вариабельные участки легких (V_L) и тяжелых(V_H) цепей молекулы иммуноглобулина формируют домен молекулы, который связывает специфический антиген – активный центр антитела.

Характеристика основных классов Ig - (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

Исследования аминокислотного состава С_Н областей тяжелых цепей у людей позволило выделить пять типов тяжелых цепей обозначенных -, -,  - ,- и  , имеющих молекулярную массу от 50 000 до 70 000. Тип Н цепей определяет класс иммуноглобулина и его функциональные особенности. Выделяют 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgD и IgЕ. Структурные особенности С_Н областей тяжелых цепей позволяет в каждом классе выделить отдельные подклассы иммуноглобулинов.

Регуляция экспрессии генов Ig и причины их разнообразия.

Каждый человек способен к образованию антител, направленных против возможно более миллиона различных антигенов. Порождение такого огромного разнообразия антител зависит от комбинаций различных структурных генов, способствующих формированию каждой цепочки иммуноглобулина и высокой частоты соматических мутационных событий в перестраиваемых генах V_Н и V_L.

Рассмотрим этот вопрос на примере рекомбинации генов, кодирующих тяжелые цепи. В ДНК лимфоцитов содержаться гены константных областей пяти классов и гены вариабельных областей трех типов: 300-400 разных генов V, около 20 разных генов D и 4 разных гена J. Эти группы генов расположены в разных участках ДНК. В результате транспозиции происходит объединение трех разных генов V, D и J в полный ген вариабельной области цепи Н. При этом выбор каждого гена из группы соответствующих генов происходит случайно: любой ген V_i из сотен генов V может оказаться объединенным с любыми генами D_i и J_i из групп соответственно D и J. Далее, также путем транспозиции, полный ген вариабельной области может объединиться с любым из генов константной области, в результате получается полный ген соответствующей Н-цепи. Общее число вариантов полного гена Н-цепи равно примерно 4000. Сходным путем образуются и гены легких цепей; их тоже может быть около 4000 вариантов. При образовании иммуноглобулинов цепи Н и L могут соединяться в разных сочетаниях, поэтому общее число разных иммуноглобулинов достигает порядка 10⁷ (4000*4000=1,6*10⁷).

Поскольку распределение генов при транспозиции имеет случайный характер, в разных лимфоцитах образуются разные сочетания генов V, D, J и С в полном гене иммуноглобулиновой цепи, т.е. происходит дифференциация лимфоцитов и образование клонов, различающихся генотипически. Соответственно, они различаются и фенотипически – по способности синтезировать антитела определенной специфичности.

Регуляция экспрессии генов Ig:

Для многих регуляторных белков биосинтез ограничен клетками строго определенных типов. Например, октамерсвязывающий белок Oct-2 , участвующий в активации экспрессии генов иммуноглобулинов в B-лимфоцитах, обнаруживают только в клетках, синтезирующих иммуноглобулины. Экспрессия рекомбинантного гена, кодирующего Oct-2, в клетках HeLa приводит к активации экспрессии генов иммуноглобулинов на уровне транскрипции. Таким образом, для осуществления тканеспецифической регуляции экспрессии генов в этом примере необходим тканеспецифический синтез белка-активатора транскрипции.

6. Патология белкового обмена. Нарушение переваривания и всасывания, последствия ахилии. Белковое голодание, квашиоркор, их последствия и основные проявления. Биосинтез дефектных белков. Первично - и вторично-дефектные белки. Относительно патологические белки. Поврежденные белки.

Патология белкового обмена.

В организме практически нет депо белков. Источником аминокислот для их синтеза служат компоненты пищи. При нарушении переваривания и всасывания белков развивается алиментарная белковая недостаточность. Нарушения белкового обмена возможны на всех этапах, начиная с всасывания и заканчивая выведением из организма конечных продуктов обмена. Кроме того, при повреждении генетического аппарата изменяется синтез белков или синтезируются белки с измененной структурой.

Нарушение переваривания и всасывания, последствия ахилии.

При заболеваниях пищевода и кишечника (рак пищевода, непроходимость пищевода или кишечника и т.д.) возникает проблема введения белков в организм. Введение белков парэнтерально, т.е. минуя желудочно-кишечный тракт, вызывает сенсибилизацию организма, а при повторном введении может развиться анафилаксия. Для предотвращения указанных реакций принято вводить парэнтерально (минуя ЖКТ) смеси аминокислот, которые не обладают специфичностью и их можно долго применять без значительных осложнений.

Кроме того проблемы с пищеварением белков могут возникнуть на стадии переваривания в желудке из-за уменьшения секреции либо отсутствия секреции соляной кислоты. Ахилия (Achylia) - отсутствие секреции HCl. Данный термин применяется обычно по отношению к желудку, не вырабатывающему желудочный сок - желудочная ахилия (achylia gastrica), вследствие атрофии его слизистой оболочки. Отсутствие HCl может обуславливать процессы бактериального гниения в кишечнике, в результате чего иногда возникает диарея.

Из-за хронического энтерита (хроническое воспалительное заболевание тонкой кишки) развивается гипопротеинемия. Ее наличие объясняется не только нарушением гидролиза белков и всасывания аминокислот кишечной стенкой, но и повышенной экссудацией белков, в основном альбуминов, в просвет кишки при ее воспалительных поражениях.

Белковое голодание, квашиоркор, их последствия и основные проявления.

В настоящее время идентифицировано более 200 различных белков в плазме клеток крови, биологических жидкостей и тканей. Это позволяет понять, почему дефицит белка дает многочисленные дефекты.

Следствием белкового голодания является белковая недостаточность, которая может быть следствием не только дефицита белка, но и ряда заболевания, на фоне достаточного поступления белка с пищей. Белковая недостаточность развивается как при наличии, и при частичном голодании, а также при приеме однообразного белкового питания, когда в диете преобладают белки растительного происхождения. Результатом этого является развитие гипоальбуминемии, нарушение осмотического давления (вследствие дефицита альбуминов, которые связывают воду). Осмотическое давление при этом падает, и жидкость уходит в ткани, вызывая отеки. Такой формой пищевой дистрофии при белковой патологии является квашиоркор. Заболевание распространенно в развивающихся странах. Причина квашиоркора - дефицит белков в пище. Новорожденный ребенок до 3-х летнего возраста вскармливается только молоком матери, потом потребляет низкобелковую диету (вода, рис, фрукты). В результате уровень поступающего в организм белка снижен, снижается соответственно уровень и активность протеаз, вследствии этого белок плохо усваивается. Белки необходимы организму как главные пластические элементы, поэтому при квашиоркоре наблюдается остановка роста, атония мышц, нарушения репарации и регенерации почки, почка имеет вид красной корочки, как после ожога.

Т.к. белки необходимы для образования транспортных форм липидов (ЛП), то их дефицит приводит к дефициту синтеза ЛП и нейтральный жир (ТГ) накапливается в ткани, вызывая жировую дегенерацию.

Белок необходим для синтеза гемоглобина, и дефицит белка проявляется в виде анемии.

Белки необходимы для иммунологической защиты, их дефицит приводит к развитию вторичного иммунодефицита.

Одним из более ранних нарушений азотистого обмена при белковой недостаточности является резкое снижение интенсивности дезаминирования, трансаминирования и биосинтеза аминокислот, а также биосинтеза мочевины. Эти нарушения обусловлены недостаточным синтезом белковой части ферментов, катализирующих эти реакции. Исключение составляет аргиназа, активность которой не нарушается. Следствием этих нарушений является увеличение концентрации а/к в крови (до 10-25%, в норме 1-2%) и уменьшении концентрации мочевины.

При белковой недостаточности отмечены также специфические изменения обмена отдельных а/к. В частности нарушения обмена ТРП (триптофана) сопровождается накоплением ксантуреновой кислоты, которая оказывает токсическое действие на бета-клетки островков Лангерганса pancreas, являясь тем самым одним из этиологических факторов диабета.

Биосинтез дефектных белков.

Измененный синтез белков может быть результатом

• нарушений в работе белоксинтезирующей системы – аппарата трансляции или посттрансляционной модификации молекул. С увеличением частоты ошибок трансляции в процессе жизни связывают старение организма.

• дефекта регуляции; на клеточном уровне – это воздействие метаболитов, на уровне организма – гормоны и нервная система.

Первично - и вторично-дефектные белки.

Все патологические белки делятся на 2 группы.

1. Первично – патологические синтезированы за счет дефектного генома:

• фенилкетонурия;

• болезнь Леха-Нихана;

• серповидно-клеточная анемия (нарушение синтеза Hb)

• болезнь Вильсона-Коновалова (проявляется в 10-12 лет; причина - отсутствие церулоплазмина-Cu-переносящего белка; Cu накапливается в печени, роговице, почках, узлах нервной системы, вызывая дегенерацию).

1. Вторично – патологические: возникают благодаря постороннему воздействию:

• введение антибиотиков на этапе трансляции белка;

• нарушение процессинга коллагена при гиповитаминозе С;

• извращение процессинга при воздействии токсических веществ (например, возникновение гликозилированного Hb при сахарном диабете обусловлено тем, что альдегидная группа глюкозы взаимодействует с аминогруппой глобина).

Кроме дефектов белков - ферментов могут возникать дефекты белков неферментной природы: индивидуальных белков плазмы ( альбуминов, ЛП), белков системы свертывания крови, Hb, Ig, белков комплемента, калликреин-кининовой системы.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ЗАНЯТИЯ

Лабораторная работа:

№1. Определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.

Грицук А.И. Практическая биохимия: Учебное пособие. ч.1. – Гомель, 2002. – С. 88–93.

5. ХОД ЗАНЯТИЯ.

5.1 Проведение устного теоретического опроса.

5.2 Проведение письменного контроля по теоретическим знаниям.

5.3 Выполнение лабораторной работы.

5.4 Выводы по лабораторной работе. Подведение итогов.

Лабораторная работа №1: Определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.

ПРИНЦИП МЕТОДА: В основе рефрактометрии лежит различная преломляющая способность жидких сред, количественно выражаемая коэффициентом преломления (отношение синуса угла падения () к синусу угла преломления ():

Sin 

n = ,

Sin 

который в сыворотке крови обусловлен в основном количеством, качеством растворенного белка и температурой. Влияние других компонентам сыворотки крови на коэффициент преломления значительно меньше. Определение коэффициента преломления проводят с помощью рефрактометров.

Содержание белка (%) в плазме (сыворотке) крови

Коэффициент преломления	Содержание белка (%)	Коэффициент преломления	Содержание белка (%)
1,33705	0,63	1,34575	3,68
1,33743	0,86	1,34612	5,90
1,33781	1,08	1,34650	6,12
1,33820	1,30	1,34687	6,34
1,33858	1,52	1,34724	6,55
1,33896	1,74	1,34761	6,77
1,33934	1,96	1,34798	6,98
1,33972	2,18	1,34836	7,20
1,34000	2,40	1,34873	7,42
1,34048	2,62	1,34910	7,63
1,34086	2,84	1,34947	7,85
1,34124	3,06	1,34984	8,06
1,34162	3,28	1,35021	8,28
1,34199	3,50	1,35058	8,49
1,34237	3,72	1,35095	8,71
1,34275	3,94	1,35132	8,92
1,34313	4,16	1,35169	9,14
1,34350	4,38	1,35205	9,35
1,34388	4,60	1,35242	9,57
1,3442	4,81	1,35279	9,78
1,34463	5,03	1,35316	9,99
1,34500	5,25	1,35352	10,20
1,34537	5,47	1,35388	10,41

РАСЧЕТ: Определив показатель преломления по таблице, вычисляют процент содержания белка в сыворотке крови; для перехода к единицам системы СИ (г/л) результат следует умножить на 10.

НОРМА: содержание общего белка в плазме (сыворотке) крови здорового человека составляет 6.5-8.5 % или 65-85 г/л.

6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1 Активация аминокислот происходит с помощью фермента:

а) лигазы; б) фосфатазы; в) РНК-азы; г) пептидазы; д) синтетазы; е) лиазы?

2 Аминокислоты в белках ковалентно связаны:

а) силами Ван-дер-Ваальса;	г) фосфоэфирными связями;
б) пептидными связями;	д) водородными связями;
в) гидрофобными связями;	е) координационными связями?

3 Какие белки узнают терминирующие кодоны мРНК:

а) факторы освобождения;	в) факторы элонгации;
б) ферменты рестрикции;	г) CAP-связанные белки?

4 Характерной чертой рибосом эукариот является:

а) наличие двух субъединиц – 30 и 50 S;	г) присутствие ДНК;
б) наличие двух субъединиц – 40 и 60 S;	д) наличие фосфолипидов;
в) высокая АТФазная активность;	е) наличие гистонов?

5 Точковая мутация мРНК будет наиболее вероятной причиной:

а) распада мРНК; б) инактивации рибосом; в) изменения первичной структуры белка; г) незавершенной транскрипции; д) подавления сплайсинга?

6 Внутривенное введение радиоактивной меченой аминокислоты взрослому животному приводит:

а) к инкорпорации эквивалентных количеств меченой аминокислоты во все белки организма; б) инкорпорации различных количеств меченой аминокислоты в отдельные белки организма; в) меченая аминокислота не инкорпорируется в белок; г) быстрой и полной экскреции меченой аминокислоты; д) вытеснению и экскреции равного количества немеченной аминокислоты?

7 Белки синтезируются:

а) от N-конца к С-концу;	г) с матрицы иРНК;
б) от С-конца к N-концу;	д) от 3’-конца к 5’-концу РНК;
в) с матрицы рРНК;	е) от 5’-конца к 3’-концу РНК?

8 Основные каталитические функции в рибосоме осуществляют:

а) факторы инициации; б) факторы элонгации; в) факторы терминации; г) р-РНК; д) синтетазы; е) рибосомальные белки?

9 Каждая рибосома в полисоме:

а) движется по мРНК в направлении 3`  5`; б) движется по мРНК в направлении 5`  3`; в) синтезирует многие полипептидные цепи; г) синтезирует только одну полипептидную цепь; д) диссоциирует по окончании синтеза; е) подавляется актиномицином D?

10 Укажите основной фермент, ответственный за реализацию информации генома ретровирусов:

а) ДНК-лигаза; б) ДНК-полимераза; в) обратная транскриптаза (ревертаза); г) РНК-полимеразы; д) АРС-аза?

11 Какая из нуклеиновых кислот в животной клетке отличается большей стабильностью:

а) мРНК; б) рРНК; в) ДНК; г) мяРНК; д) предшественники тРНК; е) гяРНК?

12 Денатурированная ДНК лимфоцитов человека не будет гибридизироваться:

а) с рРНК лимфоцитов;	в) денатурированной ДНК митохондрий;
б) тРНК почки;	г) мРНК мозга?

13 Дифтерийный токсин подавляет биосинтез белка на этапе и путем:

а) инициации; б) элонгации; в) терминации; г) процессинга иРНК; д) сплайсинга иРНК; е) рибозилирования ФЭ-2; ж) ограниченного протеолиза; з) аденилирования белка; и) метилирования белка; к) фосфорилирования белка?

7. ЛИТЕРАТУРА

Основная

1. Материал лекций.

2. Биологическая химия: учебник/ В.К Кухта., Т.С.Морозкина, и др ; под ред. А.Д.Тагановича.- Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. С. 387-418

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 354–364; 1998. С. 509–544.

5. Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 92–156.

Дополнительная

6. Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 2, С. 94–126, 321–325.

7. Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 272–297.

8. Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. С. 176–253.

9. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 3. С. 926–994.

10. Троицкий В. Г. Дефектные белки – постсинтетическая модификация. Киев: Наукова думка, 1991. С. 48–226.

Методическая разработка составлена асс. каф. биохимии Громыко М.В.