Рентгенологические изменения в лапах крыс

Рентгенологическое исследование показало наличие патологических изменений костной ткани в пораженной конечности на фоне введения адъюванта. При применении исследуемых веществ патологические изменения были выражены в различной степени и разделены нами на слабо выраженные, средне выраженные и выраженные.

	Рентгенограмма интактной конечности крысы. Костно-патологических и костно-травматических изменений на рентгенограмме не определяется. Зоны роста закрыты, высота суставных щелей сохранена. Соотношение кортикального слоя и костно-мозгового канала сохранено.
	Рентгенограмма пораженной конечности крысы. На фоне инфильтрации мягких тканей определяется периостальная реакция в виде утолщения и разволокнения кортикальных слоев и как следствие уменьшение ширины костно-мозгового канала. Кортиколит, узурация, кортикальная деструкция.

Моделями патологических воспалительных процессов могут служить каррагениновый отек лапы и формалиновый артрит у крыс. В эксперименте используют самцов белых беспородных крыс или крыс линии Wistar .

Острую воспалительную реакцию (отек) вызывают субплантарным (под плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина или введением в полость коленного сустава 0,1 мл 2% раствора формалина. Спустя 1 сутки получают модель острого артрита, на которой можно было испытывать противовоспалительное, обезболивающее и жаропонижающее действия изучаемых веществ. Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно по профилактической или лечебной схемам, в дозах рекомендованных для применения. Показателями противовоспалительного эффекта служат антиэкссудативное, анальгезирующее и жаропонижающее действия.

Противоотечное действие оценивается онкометрическим методом.

Анальгезирующие свойства исследуемых веществ оценивают по изменению под их влиянием порога болевой чувствительности при контактно-тепловом раздражении. Регистрируемым показателем является время латентного отдергивания пораженной конечности крысы в ответ на термическое болевое воздействие.

Жаропонижающее действие исследуемых веществ определяется по их способности снижать температуру кожи лапки крысы над очагом воспаления.

Кроме этого, унифицированными биохимическими и гематологическими методами оцениваются общие показатели активности воспалительного процесса: СОЭ, уровни ЦРБ, сиаловых кислот, фибриногена и содержание лейкоцитов.

Публикации по теме: 1.  Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G., Makarova M.N. Anti-inflammatory effect of Pinus sibirica oil extract in animal models // Nat Med (Tokyo).- 2008.- Vol. 62, N4.- P. 436-440. 2.  Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Оценка противовоспалительного действия комбинированного природного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека у крыс линии вистар. // Вестн. СПбГМА им. И.И.Мечникова – 2006.- Т. 7, №3.- С. 138-141. 3.  Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Тесакова С.В., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Противовоспалительная активность и механизм действия препарата «Артро-актив» // Фармация.- 2007.- №1.- С. 38-41. 4.  Tikhonov V.P., Rydlovskaya A., Makarov V.G., Makarova M.N, Pozharitskaya O.N. Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro and in vivo / International Congress and 54th Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research.- Helsinki, Finland 29 Aug. – 2 Sept. 2006. // Planta Medica.- 2006.- Vol. 72, N11.- P. 1007 (P 081). 5.  Alexandrova A.E., Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G. Study of anti-inflammatory effect of natural intranasal preparation for treatment of acute rhinitis / 50th Annual Congres of the Society for Medicinal Plant Research, Sept 8-12, 2002.- Revista de Fitoterapia.- 2002.- Vol. 2, Supl. 1 (Sept).- A043.

Гепатопротекторные эффекты

Круг веществ, обладающих гепатозащитными свойствами весьма велик, и, представлен веществами, способными стимулировать процессы репарации в печени и улучшать ее функциональное состояние.

Экспериментальное развитие патологии печени наиболее просто получить введением гепатотропных ядов, таких как четыреххлористый углерод ( CCl 4 ) или этанол, с развитием гепатита и цирроза печени.

Острый токсический гепатит

Хроническая интоксикация тетрахлорметаном (CCl 4 ) широко используется для экспериментального моделирования хронического гепатита и цирроза печени. Изучение патогенеза интоксикации CCl 4 в клинике, в опытах на животных и в модельных экспериментах с изолированными клеточными структурами позволило выделить два этапа при действии CCl 4 на клетки печени.

Первый этап: специфическое действие CCl 4 , который при метаболизме в монооксигеназной системе гладкого эндоплазматического ретикулума преобразуется в свободные радикалы и электрофильные интермедиаты, ковалентно связывающие биомакромолекулы центролобулярных гепатоцитов.

Кроме того, свободные радикалы, взаимодействуя с липидами мембран, инициируют перекисное окисление липидов.

Второй этап: неспецифическая реакция клетки, сопровождающаяся нарушением барьерных свойств мембран, ионного баланса, биоэнергетических процессов и как следствие изменением клеточных функций.

У белых беспородных крыс самцов (250-300 г) развитие острого токсического гепатита вызывают однократным введением CCl 4 , 50% раствор в оливковом масле, ниже представлены возможные пути введения и дозы:

Путь введения	Доза
Внутрижелудочно	4-5 мл/кг
Внутрибрюшинно	0,2-0,4 мл/кг

Через 1-3 дня в печени животных обнаруживается центральный лобулярный некроз. Исследуемые вещества вводятся внутрижелудочно, ежедневно, по профилактической или лечебной схеме. Животные подвергаются эвтаназии спустя 2 недели после отравления CCl 4 , отбор крови осуществляют из сердца. При некропсии забирают на исследование печень.

Алкогольный гепатоз

Моделирование алкогольного гепатоза у крыс осуществляется в течение 16 дней. В течение 6 дней крысам внутрижелудочно вводят 40% этанол в дозе 8 г/кг. Последующие 10 дней вводимую дозу алкоголя уменьшают в два раза (4 г/кг) и назначают исследуемые вещества. Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно через 4 часа после введения этанола, обычно в дозах 50-300 мг/кг. После эвтаназии осуществляют забор крови из сердца и забор печени для морфологического исследования.

Экспериментальный фиброз и цирроз печени

Гепатотоксический эффект алкоголя при потенцировании с CCL 4 приводит к развитию цирроза печени. Моделирование осуществляют в течение 31 дня. В течение этого времени крысы получают этанол в виде 5% раствора в качестве питья вместо воды. CCL 4 вводят внутрижелудочно по 0,1 мл/кг дважды в неделю (всего 8 доз). Лечение начинают через 3 недели и проводят его на протяжении 10 дней. Препараты вводят внутрижелудочно.

Об эффективности исследуемых веществ при патологии печени судят по клинической картине, динамике массы тела, морфометрическим, гистологическим данным и биохимическим показателям, отражающим развитие синдрома цитолиза (АлАТ, АсАТ), синдрома холестаза (щелочная фосфатаза, гамма-глутамилтрансфераза, прямой и непрямой билирубин). Проводят оценку детоксицирующей функции печени с помощью постановки гексеналовой пробы. Белоксинтетическую функцию печени оценивают по содержанию общего белка крови и альбуминов. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантной системы печени оценивают по содержанию ТБК-реагирующих продуктов в плазме крови и восстановленного глутатиона в печени.

Морфологическое исследование позволяет выявить степень целостности гепатоцитов, наличие жировой дистрофии, фиброза или цирроза.

Публикации по теме: 1.  Макаров В.Г., Александрова А.Е. Гепатозащитное действие концентрата облепихового масла и аекола в эксперименте. // V Росс. национ. конгр. "Человек и лекарство", М., 1998. - С. 586. 2.  Макаров В.Г., Лифляндский В.Г., Лобанков О.В. и др. Экс­периментально-клиническое изучение гастропротекторного и холеретического эффектов фитопрепарата "Эликсир Демидовский". // Журн. Вопросы биол. мед. и фармацевтич. химии, М. - 1998. - N 2. - С. 38-41. 3.  Макаров В.Г., Рыженков В.Е., Лобанков О.В. и др. Гиполипидемическое и гепатозащитное действие эликсира "Кедровит". // 2-ой Междун. съезд "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения" Матер., СПб., 1998. - С. 62-66. 4.  Макаров В.Г., Александрова А.Е., Дмитриева О.Л., Тесакова С.В., Бащук С.В., Самусенко И.А. Изучение гепатопротекторной активности "Сосны кедровой сибирской". Проблемы охраны здоровья населения и окружающей среды / под ред. чл.-корр. РАМН А.В. Шаброва, проф. В.Г. Маймулова, СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова. – 2002. – С. 177-178. 5.  Макаров В.Г., Чекалин Ю.Г., Александрова А.Е. и др. Гепатопротекторное действие комплексного препарата эликсир "Кедро­вит". // Тез. докл. Всеросс. научн. конф. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств". СПб., 1996. - С. 145. 6.  Макарова М.Н. Изучение антиоксидантной активности фитопрепаратов в условиях токсического гепатита // Проблемы охраны здоровья населения и окружающей среды: Тезисы науч. конференции. -СПб. -2002. -С. 178-179. 7.  Макарова М.Н., Александрова А.Е., Макаров В.Г., Куренкова Т.Ю. Изучение антиоксидантной активности препаратов на основе семян сосны кедровой сибирской (Semina pini sibiricae du tour) // Биохимия - медицине: Матер. международной науч. конференции. -Махачкала. -2002. -С. 223-226. 8.  Рыженков В.Е., Макаров В.Г., Дадали В.А. и др. Антиоксидантное, гиполипидемическое и гепатозащитное действие масла ли­монника в капсулах - препарата Ликаол. // VI Росс. национ. конгр. "Человек и лекарство", М., 1999. - С. 64. 9.  Ryzhenkov V.E., Makarov V.G., Remesova O.V. New plant origin substances: hypolipidemic and hepatoprotective action. // Canad. J. Cardiol., Absts. 4th Intcrnat. Conf on preventive cardi­ology, Montreal. - 1997. - Vol.13. - Suppl. B. - P. 343 В.

Гипогликемия и антидиабетические эффекты

Согласно Копенгагенской модели патогенеза сахарного диабета, факторы внешней и внутренней среды (вирусы, химические вещества, пищевые факторы, интерлейкин- 1бета) вызывают активацию процесса свободнорадикального окисления в клетках. Под воздействием свободных радикалов белки бета-клеток меняют свои природные свойства (денатурируют) и становятся антигенами для собственной иммунной системы. Повышенная чувствительность бета-клеток поджелудочной железы к действию свободных радикалов объясняется тем, что в ней снижена активность антиоксидантных защитных систем. Свободные радикалы вызывают нарушения в структуре ДНК инсулинпродуцирующих клеток, что приводит к последующей гибели бета-клеток.

Наиболее распространенной моделью сахарного диабета, связанной с развитием свободнорадикального окисления в бета-клетках поджелудочной железы, является аллоксановый диабет. Аллоксановый диабет вызвается однократным подкожным введением водного раствора аллоксангидрата в дозе 100-150 мг/кг голодавшим в течение суток крысам. Предварительно до введения аллоксана проводится внутрижелудочное введение исследуемых веществ по профилактической схеме, ежедневно, в течение 20 дней. На 21 день оценивается исходный уровень глюкозы и вводится аллоксан. Исследуемые вещества продолжают вводится еще в течение 14 дней. На 15 день после введения аллоксана проводится эвтаназия и стерильный забор крови для исследования. В сыворотке крови определяется уровень глюкозы, перекисное окисление липидов по концентрации продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и уровню диеновых конъюгатов. В эритроцитах оценивается концентрация гемоглобина и гликозилированного гемоглобина, активность супероксиддисмутазы. При некропсии проводится забор поджелудочной железы с последующей морфологической оценкой ее строения.

Публикации по теме: 1.  Тихонов В.П., Макаров В.Г., Александрова А.Е., Бржетский В.В., Дискаленко О.В. Сравнительная эффективность трех фитокомплексов на развитие индуцированной хориоретинальной дистрофии у кроликов // IX Междунар. съезд "Фитофарм-2005": матер. съезда. – Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005 г. – Санкт-Петербург. – 2005. – С. 352-357. 2.  Tesakova S.V., Makarova M.N., Stolaschuk N.V., Makarov V.G. Capillary-protective activity of combination of ascorbic acid and various flavonoids on a model of endothelial dysfunction // Fhytopharm. 2007. 11th International congress. Book of abstracts. Leiden. Netherlands. 27-30 June 2007. –P. 74.

Капилляропротекторные эффекты

Экспериментальное изучение биологически активных веществ, оказывающих капилляропротекторное действие

Открытие витамина Р или «витамина проницаемости» принадлежит Сент-Дьерди, который проводя опыты на морских свинках с экспериментальной цингой обнаружил, что чистая аскорбиновая кислота (витамин С) не излечивает полностью последствия цинги, а именно — подкожные кровоизлияния. Однако в тех случаях, когда они использовали в лечебных целях неочищенные растительные экстракты, последствия болезни проходили полностью.

На этом основании был сделан следующий вывод — имеется еще одно активное вещество, необходимое для полного восстановления функций организма. Таким образом, был открыт новый витамин, обладающий способностью предохранять стенки капилляров от повышенной проницаемости, и названный витамином Р (от англ. permeability – проницаемость).

Первый очищенный растительный концентрат, обладающий Р-витаминным действием, был выделен из лимона и назван в честь этого фрукта «цитрин». Биологически активными веществами в «цитрине» оказалась два гликозида фенольной природы (гесперидин и эриодиктиол). Позднее было выяснено, что большинство соединений обладающих капилляроукрепляющим действием имеют флавоноидную природу (катехины, лейкоантоцианы, флавоны, флавононы и др.).

Моделирование капилляротоксичности возможно проводить на трех экспериментальных моделях:

1) острое повреждение сосудистой стенки перекисью водорода, что позволит одновременно оценить как антиоксидантное действие БАД, содержащих флавоноиды, так и их капилляропротекторное действие;

2) хроническое повреждение сосудистой стенки на модели длительно текущего сахарного диабета;

3) нарушение капиллярного русла при дефиците витамина С.

Острое капилляротоксическое действие перекиси водорода

Моделирование острого капилляротоксического действия перекиси водорода на эндотелий сосудов.

Эксперименты проводятся на крысах массой не менее 200 г. Внутривенное введение перекиси водорода в концентрации 0,02 М и объеме 0,2 мл в хвостовую вену осуществляется в соответствии со стандартными процедурами. Исследуемые биологически активные вещества вводят за 5 дней до введения перекиси водорода ежедневно, внутрижелудочно. Последнее введение осуществляется за 2 часа до введения перекиси водорода.

Через 2 часа после введения перекиси водорода животные подвергаются эвтаназии.

Оценка капилляротоксического и капилляропротекторного действия осуществляется по биохимическим параметрам:

•  ТБК-РП;

•  диеновым конъюгатам;

•  активности супероксиддисмутазы;

•  активности каталазы;

•  активности эндотелиальной синтазы оксида азота в гомогенатах сосудов ( eNOS ).

Оцениваются морфологические параметры состояния сосудов эластического, мышечно-эластического типов и сосудов микроциркуляторного русла.

Хроническое капилляротоксическое действие на основе развития микроангиопатий

Моделирование хронического капилляротоксического действия на основе развития микроангиопатий при длительном течении экспериментального аллоксанового диабета.

Эксперименты проводятся на крысах массой не менее 200 г. Аллоксановый диабет вызывают однократным подкожным введением водного раствора аллоксангидрата в дозе 100-150 мг/кг голодавшим в течение суток крысам. В течении трех месяцев с момента введения аллоксана проводится внутрижелудочное введение исследуемых веществ по лечебной схеме, ежедневно.

В ходе эксперимента фиксируется общее состояние животных, потребление воды, масса тела.

В сыворотке крови определяется уровень глюкозы, перекисное окисление липидов по концентрации продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой и уровню диеновых конъюгатов. В эритроцитах оценивается концентрация гемоглобина и гликозилированного гемоглобина, активность супероксиддисмутазы; активность каталазы. Проводится оценка активности eNOS в гомогенатах сосудов.

Морфологическая оценка проводится по состоянию сосудов эластического, мышечно-эластического типов и сосудов микроциркуляторного русла в различных тканях: в тканях сердца - количество капилляров на единицу площади ткани; в тканях легких, поджелудочной железы, брыжейки – состояние сосудистой стенки; в тканях мозга и глаза соотношение количества перицитов и эндотелиоцитов.

Кроме того, проводится гистологическая оценка строения поджелудочной железы, как отражение течения основной патологии.

Капилляропротекторное действие при дефиците витамина С

Моделирование повышенной ломкости капилляров на морских свинках с экспериментальной цингой.

Введение исследуемых веществ осуществляется в течении 25 дней внутрижелудочно. Через 25 дней животные подвергаются эвтаназии. В ходе эксперимента фиксируется общее состояние животных, масса тела.

Оценка антискорбутного и капилляропротекторного действия осуществляется по биохимическим параметрам, а также морфологическим параметрам, оценивающим состояние сосудов эластического, мышечно-эластического типов и сосудов микроциркуляторного русла.

Публикации по теме: 1.  Tesakova S.V., Makarova M.N., Stolaschuk N.V., Makarov V.G. Capillary-protective activity of combination of ascorbic acid and various flavonoids on a model of endothelial dysfunction // Fhytopharm. 2007. 11th International congress. Book of abstracts. Leiden. Netherlands. 27-30 June 2007. –P. 74.