Определение каталазной активности
Оценку активности каталазы осуществляют по скорости снижения концентрации перекиси водорода в инкубационной среде. Регистрация осуществляется спектрофотометрически при длине волны 230 нм.
Определение супероксиддисмутазной активности
Генерацию супероксиданион радикала осуществляют в ксантин-ксантиноксидазной реакции. Ксантиноксидаза в присутствии кислорода воздуха катализирует реакцию окисления ксантина с образованием О 2 радикал . Супероксиданион радикал вступая в реакцию с р -нитрофенилтетразолием хлоридом, образует окрашенное в красный цвет соединение формазан с max поглощения 540 нм.
Определение концентрации восстановленного глутатиона
Принцип метода основан на способности низкомолекулярных тиоловых соединений, при взаимодействии с реактивом Эллмана образовывать окрашенное соединение (тио-2-нитробензойная кислота), водный раствор которого имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм.
Определение концентрации продуктов ПОЛ – ТБК-реагирующих продуктов
Принцип метода основан на реакции взаимодействия малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного продукта. Измерения проводят при длине волны 535 и 580 нм.
Определение глутатионпероксидазной активности
Принцип метода: глутатионпероксидаза, используя в качестве кофермента восстановленный глутатион, катализирует восстановление гидроперекиси трет-бутила. Об активности глутатионпероксидазы судят по скорости убыли концентрации восстановленного глутатиона. После 5-ти минутной инкубации на водяной бане при t=37 0 С реакцию останавливают 20% трихлоруксусной кислотой. Для регистрации оставшегося после реакции глутатиона к супернатанту в Трис-ЭДТА буфере (рН 8,5) добавляют реагент Эллмана. Оптическую плотность каждой пробы измеряют против воды на спектрофотометре при длине волны 412 нм.
Другим вариантом этого метода является определение активности фермента в сопряженной с глутатионредуктазой системе по скорости окисления НАДФН. Оптическую плотность каждой пробы измеряют против воды на спектрофотометре при длине волны 340 нм. При этом способе оценке не требуется использование реагента Эллмана, а также возможен кинетический способ измерения.
Определение глутатионредуктазной активности
По мере восстановления окисленного глутатиона расходуется эквимолярное количество НАДФН, скорость уменьшения концентрации которого регистрируют по снижению оптической плотности при длине волны 340 нм. Неспецифическую НАДФН-оксидазную активность учитывают с помощью холостой пробы, не содержащей глутатион.
Определение глутатион-s-трансферазной активности
Принцип метода: основан на оценке скорости ферментативного образования GS-2,4-динитробензола в реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом, водный раствор образующегося продукта имеет максимум поглощения при лямбда = 340 нм.
Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности
Метод основан на спектрофотометрическом определении количества восстановленного NADPH , образующегося при окислении глюкозо-6-фосфата в фосфоглюконолактон. По мере образования NADPH светопоглощение пробы при длине волны 340 нм возрастает.
Молекулярные механизмы антиоксидантной активности (редокс-чувствительные факторы транскрипции)
За компенсаторный ответ на воздействие реакционных продуктов неполного восстановления кислорода отвечают два транскрипционных фактора: OxyR и SoxRS . При взаимодействии с перекисью водорода входящие в состав тетрамера OxyR остатки цистеина окисляются и белок переходит из восстановленной формы в регулярно окисленную, под действием которой усиливается транскрипция генов, кодирующих ферменты метаболизма H 2 O 2 (каталаза, НАДФН-зависимая алкилгидропероксиредуктаза), белки регуляции окислительно-восстановительного баланса (глутатионредуктаза, глутаредоксин-1, тиоредоксин-2).
Увеличение содержания SoxRS приводит к усилению транскрипции около 100 генов, в том числе отвечающих за синтез супероксиддисмутазы 2, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.
Еще одним важнейшим транскрипционным фактором является фактор транскрипции NF - кB ( nuclear factor кB ). NF - кB B играет ключевую роль в развитии воспалительного процесса, регулируя экспрессию белков острой фазы, молекул адгезии и провоспалительных цитокинов, регулирует апоптоз. Под его влиянием происходит индукция синтазы оксида азота. Прямое действие перекиси водорода на клетки приводит к активации NF -кB , а антиоксиданты ингибируют его активность.
Среди редокс-чувствительных факторов транскрипции особое место занимает антиоксидант-респонсивный элемент ARE ( antioxidant responsive element ). Главным назначением регуляторной системы ARE является поддержание внутреннего гомеостаза при апоптоз-индуцирующих, канцерогенных и стрессовых воздействиях. Посредством индукции синтеза Mrp 1 ( multidrug resistance - associated protein -1), ключевого белка АТФ-зависимого экспорта ксенобиотиков из клеток, ARE может участвовать в развитии множественной лекарственной устойчивости. Этим определяется биологическая важность ARE , ибо от его функционирования зависит работа других редокс-чувствительных факторов и систем, в том числе отвечающих на внешние сигналы.
Для индукторов ARE важны окислительно-восстановительные свойства молекул, однако антиоксидантные свойства и ARE -индуцирующее действие веществ не связаны между собой. Сегодня известна способность активировать транскрипцию генов, регулируемых с участием ARE для фенолов природного происхождения (эллаговая кислота, флавоноиды, изотиоцианаты, полифенолы экстрактов зеленого чая) и синтетического ( трет -бутилгидрохинон, трет -бутилгидроксианизол, пробукол).
При этом бензол и фенол, также как и бутилгидрокситолуол, не проявляют ARE индуцирующей активности; простые ди- и трифенолы активны только при наличии ОН-групп в орто- (катехол) или пара -положениях (гидрохинон).
Помимо фенолов, этой способностью обладают аскорбиновая кислота, SH -содержащие соединения (изотиоцианаты, 1,2-дитиолтионы), каротиноиды, гемовые комплексы. Среди полиеновых каротиноидов ARE индуцируют ликопин и в меньшей степени бета-каротин, в то время как астаксантин такой способностью не обладает.
Публикации по теме: 1. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Смирнов Л.Д., Буданов С.В., Пахомов В.П., Демченкова Е.Ю., Онацкий Н.М. Методические указания по изучению антиоксидантной активности фармакологических веществ// Ведомости НЦ ЭСМП. -2007, № 2. –С. 96-103. 2. Макарова М.Н., Кузнецов А.С., Зенкевич И.Г., Макаров В.Г. Флуориметрический метод оценки антирадикальной активности природных антиоксидантов по отношению к гидроксильным радикалам // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Матер. VI международного съезда. –СПб. –2002. –С. 437-441. 3. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Зенкевич И.Г. Антирадикальная активность флавоноидов и их комбинации с другими антиоксидантами // Фармация. -2004, № 2. –С. 30-32. 4. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Станкевич Н.М., Ермаков С.Б., Яшакина И.А. Характеристика антирадикальной активности и состава экстрактов из растительного сырья // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2004, 21-23 июня: Матер. VIII международного съезда. –Миккели, Финляндия. –2004. –С. 464-470. 5. Макаров В.Г., Макарова М.Н. Антиоксиданты и реакционно-активные формы кислорода. Их роль и механизм действия // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2004, 21-23 июня: Матер. VIII международного съезда. –Миккели, Финляндия. –2004. –С. 121-132. 6. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Селезнева А.И. Сравнительная оценка антирадикальной активности флавоноидов по отношению к гидроксильным и супероксиданион радикалам в экспериментах in vitro // Вестн. СПбГМА им. И.И. Мечникова. -2004. -№ 4. -С. 108-110. 7. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Селезнева А.И. Изучение механизма антиоксидантного действия витаминов и флавоноидов // Вопросы питания. -2005. –Т. 74, №1. –С. 10-13. 8. Макарова М.Н., Макаров В.Г., Станкевич Н.М., Ермаков С.Б., Яшакина И.А. Экстракты из растительного сырья. характеристика антирадикальной активности и состава // Растительные ресурсы. -2005, вып. 2. –С. 106-115. 9. Макарова М.Н., Пожарицкая О.Н., Иванова С.А., Шиков А.Н., Макаров В.Г., Тихонов В.П. Выделение биоактивных фракций из плодов черники (Vaccinium myrtillus L.) и оценка их антиоксидантных свойств in vitro // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 116-121. 10. Макарова М.Н., Макаров В.Г. Обзор методов оценки антирадикальной активности природных соединений // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 102-116. 11. Карлина М.В., Пожарицкая О.Н., Дадали Ю.В., Косман В.М., Шиков А.Н., Макаров В.Г. Светопоглощающие и антирадикальные свойства продукта на основе лютеина и зеаксантина в опытах in vitro и оценка кинетики каротиноидов при однократном пероральном применении у крыс // Вопросы питания.- 2008.- Том 77, №3.- С. 34-38. 12. Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Шиков А.Н., Макаров В.Г. Постхроматографическая оценка антиоксидантной активности семян сосны кедровой сибирской Pinus sibirica по DPPH радикалу методом ТСХ / материалы III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», 23-27 апреля 2007 г.: в 3 кн./ под ред. Н.Г.Базарновой, В.И.Маркина.- Барнаул: Изд-во Алт. ун-ва, 2007.- кн. 2.- С. 216-220. 13. Pozharitskaya ON., Ivanova SA., Shikov AN., Makarov VG. Separation and free radical-scavenging activity of major components of Curcuma longa using HPTLC-DPPH method // Phytochemical analysis.- 2007.- Vol. 10. 14. Pozharitskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG., Galambosi B. Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of green, brown and black leaves of Bergenia crassifolia by using HPTLC-DPPH• method // // J Sep Sci.- 2007.- Vol. 30, N15.- P. 2447-2451. 15. Makarova M.N., Tesakova S.V., Eshenko A.Yu., Siivari J., Galambosi B., Zenkevich I.G. Study of antiradical activity of Bergenia ssp. leave samples in vitro // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2006, 27-30 июня: Матер. X международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2006. –С. 488-493. 16. Pozharitskaya ON., Ivanova SA., Shikov AN., Makarov VG. Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of Emblica officinalis extract by using HPTLC-DPPH• method // J Separation Science.- 2007.- Vol. 30, N 9.- P. 1250-1254
Физиологические тесты (анксиолитический, адаптогенный, актопротекторный эффекты)
Целостноcть физиологической реакции крыс на те или иные модельные раздражители или на введение исследуемых веществ оценивается в физиологических тестах с учетом ориентировочно-исследовательского эмоционального, стереотипного и двигательного компонентов по поведенческому атласу для грызунов (Пошивалов В.П., 1978). Пошивалов В.П. Этологический атлас для фармакологических исследований на лабораторных грызунах. М. Деп. В ВИНИТИ, № 3164-78. 1978.
Спонтанная двигательная активность
Свободную двигательную активность животных исследуют в тесте «открытого поля», представляющего собой квадратную площадку площадью 1 м 2 , ограниченную непрозрачными бортами высотой 20 см. Освещенность открытого поля составляет 100 лк. Во время опыта экспериментальный вольер находится в специальной звукоизолированной комнате. Продолжительность опыта для каждой отдельной крысы составляет 3 минуты. Регистрируются ряд элементарных двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле».
Тест принудительного плавания
В качестве экспериментальных животных используют мышей или крыс. Первое плавание животных проводят с целью рандомизации животных по устойчивости к физической нагрузке. Каждое животное по одному самцу помещают в цилиндр с водой, диаметром 18 см, высотой 40 см, т.е. достаточного размера для того, чтобы крысы или мыши в нем могли свободно плавать. Температура воды поддерживается в пределах 29-30 градусов . Плавание осуществляется с грузом (свинцовая трубка на резиновом кольце, прикрепляемая к корню хвоста), равным 10% от веса тела. Животные плавают с грузом до утомления, о котором свидетельствует погружение животного на дно цилиндра. В этот момент животное быстро извлекается из воды и в течение двух минут обсушивают сухим полотенцем, после чего животным вводят исследуемые вещества. Животные, длительность плавания которых при рандомизации отклоняется от среднего времени плавания на 35%, исключаются из эксперимента.
Через 2 часа проводят повторное плавание с грузом до утомления, о котором судят по длительности плавания животного до погружения на дно цилиндра. В момент погружения животное быстро достают из воды, обсушивают сухим полотенцем и подвергают эвтаназии с забором органов и крови для исследования.
При необходимости исследовать вещества, требующие длительного применения, после рандомизации животным вводят исследуемое вещество в течении 5-10 дней, после чего воспроизводят тест.
|
|
При анализе крови оценивают общий белок, альбумины, лактат, пируват, небелковые компоненты крови. Органы взвешиваются, рассчитываются массовые коэффициенты тимуса, надпочечников. На слизистой оболочке желудка оценивается наличие язв и геморрагий.
Тест влияния исследуемого вещества на выносливость мышей к скоростной нагрузке
Влияние на выносливость к скоростной физической нагрузке следует определять на 10-дорожном третбане при скорости движения полотна 40 м/мин.
Моментом окончания опыта считается пребывание животных на электрической сетке третбана под напряжением 25 В более 10 с. Опыт проводят при двух функциональных состояниях животных: на фоне относительного покоя (свободного содержания животных в клетках) и на фоне предварительной физической нагрузки. Нагрузку осуществляют с помощью принудительного бега животных на третбане при скорости движения ленты 28 м/мин в течение 5 мин. Животные, получившие предварительную физическую нагрузку, разделяются на 2 подгруппы. В первой подгруппе мыши подвергаются однократной физической нагрузке в течение 5 мин. Вслед за этим животным вводят изучаемое вещество и спустя 1 ч исследуют скоростную выносливость. Животные второй группы ежедневно получают дозированную физическую нагрузку в течение 7 дней. В первый день длительность бега составляет 5 мин, в другие дни продолжительность нагрузки последовательно увеличивают на 1 мин. Сразу же за проведением нагрузки мышам вводят изучаемое вещество. На 7-й день через 1 ч после последнего введения добавки у животных изучают скоростную выносливость. Во всех экспериментах исследуемое вещество вводят внутрижелудочно.
Влияние на высшие интегральные функции мозга на модели УРПИ (условный рефлекс пассивного избегания) См. раздел оборудование.
Выработка УРПИ основана на врожденном стремлении мышей и крыс к ограниченному замкнутому пространству (норковый рефлекс). Экспериментальная камера для мышей состоит из 2-х отделений, большего, освещенного (с прозрачными стенками) размером 125х135х190 мм, и меньшего, затемненного, размером 90х100х180 мм с электропроводным полом. Мышь помешают в центр освещенного отделения хвостом к перегородке с отверстием, которая разделяет большее отделение от меньшего. Найдя отверстие в перегородке, мышь переходит из освещенного отделения в затемненное. В течение 3 минут регистрируется общее время пребывания животного в меньшем отделении и время первого захода в него. По истечении З мин в момент, когда мышь находится в затемненном отделении, ей через пол наносят электроболевое раздражение силой 0,45 мА до тех пор, пока животное не выбегает в освещенное отделение. Если в течение 10 с мышь не возвращается в затемненное отделение, ее удаляют из камеры и возвращают в клетку, если же заходит, повторно наносят электроболевое раздражение. Сохранность УРПИ тестируется через 24 ч после его выработки, помещая мышь в освещенное отделение. При оценке сохранности УРПИ учитывают число животных в процентах, зашедших в затемненный «опасный» отсек камеры за 3 мин наблюдения, время первого захода в него, общее время пребывания в нем при тестировании, разницу во времени пребывания животного в затемненном отделении до выработки УРПИ и при его тестировании ( дельта t ). Чем лучше помнит животное о нанесенном в затемненной отделении элекроболевом раздражении, тем меньше времени оно находится в темноте, тем больше латентное время первого захода в «опасное» отделение, тем больше дельта t и тем меньше животных зайдет в «опасное» затемненное отделение камеры.
Влияние на обучаемость в методике условного рефлекса активного избегания
Изучение влияния веществ на процесс обучения предпочтительно проводить, используя методику двустороннего избегания болевого раздражения через электродный пол в челночной камере типа Shuttle - Box у мышей и крыс. Использование модели активного избегания позволяет проводить обучение при многократных повторениях и оценить динамику выработки условного рефлекса. Установка состоит из двух отделений, разделенных перегородкой, в которой имеется дверца. Оба отделения имеют отдельно электрифицированный пол. Условным раздражителем является свет, звук, которые предъявляются за 6 - 10 с до безусловного раздражителя, которым является электроболевое раздражение (50 -100 Гц, 20—30 В, 10 мс), подаваемое через электродный пол поочередно то в одном, то в другом отделении. Чтобы не получить болевого раздражения, животное должно обучиться перебегать в другой отсек камеры во время действия условного сигнала (условный рефлекс). Перебегание в другой отсек в ответ на действие болевого раздражителя является безусловным рефлексом (реакция избавления). Схема выработки условного рефлекса активного избегания состоит в следующем. Животное получает ежедневный сеанс обучения, состоящий из стандартного числа сочетаний условного и безусловного раздражителей (например, 10, 20, 30); регистрируется число условных и безусловных ответов. Обучение продолжается или до полной выработки условного рефлекса активного избегания, когда при предъявлении условного сигнала животное выполняет рефлекс избегания в 100 % и не получает болевых раздражений, или же до определенного, выбранного экспериментатором критерия. Во всех случаях ежедневно регистрируется количество условных реакций избегания и реакций избавления за сеанс обучения и время (в секундах) выполнения этих рефлексов, а также общая продолжительность обучения до выбранного критерия. Испытуемые вещества вводят перед сеансом обучения или непосредственно после сеанса обучения. Контрольной группе вводят изотонический раствор натрия хлорида или дистиллированную воду.
Влияние на обучаемость в методике условного рефлекса с положительным подкреплением
Условный пищевой или питьевой рефлекс вырабатывается у животных, как правило, в однодорожечной камере, У- или Т- образном лабиринте. Крыс с питьевой (пищевой) депривацией в течение 48 ч помещают в стартовый отсек У- или Т-образного лабиринта, в одном из рукавов которого помещена кормушка с водой (пищей). Через 30—60 с после посадки открывают дверцу стартового отсека. Световой звуковой сигнал или щелчок открывания дверки служит условным раздражителем. Регистрируется время побежки животного от стартового отсека до кормушки, число правильных и неправильных ответов (заходы в пустой рукав). Рассчитывается среднее для группы время выработки рефлекса до определенного критерия, процент животных с выработанным рефлексом за определенное количество сочетаний, число сочетаний, требуемое для выработки рефлекса до критерия. В качестве критерия выработки рефлекса выбирается обычно 8 правильных пробежек из 10 предъявляемых. При выработке пищевого рефлекса существенным представляется выбор пищевого подкрепления и условия содержания животных. В качестве подкрепления применяют кусочки хлеба или сыра массой 0,15—0,20 г, зерна подсолнечника. В условиях предшествующей выработке рефлекса пищевой депривации (48 ч) животные имеют свободный доступ к воде. Кормление животных вне эксперимента должно осуществляться в одно и то же время суток, обычно после окончания экспериментов. Пища должна быть стандартной и калорийной. За время опыта по выработке рефлекса падение массы животного не должно превышать 20 % от исходного уровня.
Анксиолитические эффекты
Для оценки эмоционально-поведенческих реакций на стресс и оценки стресс-протекторных эффектов могут быть использованы крысы или мыши самцы. Введение исследуемых веществ осуществляется до начала эксперимента в течение 5 дней в дозах и по схеме предусмотренных для применения.
После проведения эксперимента животные подвергаются эвтаназии и некропсии, при этом регистрируется вес тимуса и надпочечников, наличие геморрагий и язв слизистой желудка.
Оцениваются биохимические параметры стресса: общий белок, небелковые компоненты крови, показатели антиоксидантной системы.
«Приподнятый крестообразный лабиринт - ПКЛ»
Поведение крыс в «ПКЛ» исследуют в крестообразной установке, состоящей из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещают в центр лабиринта. Фиксируют время пребывания в закрытых и открытых «рукавах», количество заходов в закрытые и открытые «рукава», длительность нахождения в центре. Продолжительность теста для каждой отдельной крысы составляет 3 минуты. См. раздел оборудование.
Тест «иммобилизационный стресс»
В эксперименте используются белые беспородные крысы самцы. Иммобилизация создается путем жесткой фиксации крыс в положении на спине за 4 конечности без ограничения подвижности головы в течение 6, 12 или 24 часов.
Метод четырех пластин
Метод четырех пластин основан на подавлении ориентировочно-исследовательского поведения грызунов электроболевым раздражителем. Крысу (мышь) помещают на одну из четырех пластин, составляющих пол камеры, после ознакомления с обстановкой (15-30 с) при переходе животного с пластины на пластину оно получает болевое раздражение, подаваемое через пол, в результате чего повышается уровень тревожности и уменьшается число переходов.
Гипоксия и ишемия
Экспериментальное изучение биологически активных веществ, предотвращающих развитие гипоксических и ишемических нарушений
Несмотря на то, что в нашей стране исследования по проблеме кислородного голодания были начаты еще в 19 веке, только к 60-м годам 20-го столетия сложилось современное представление о гипоксии, как о важнейшем выражении общей патологии, приводящей к повреждению клеток, вызываемых различными физическими, химическими и биологическими факторами. Главным патогенетическим звеном при кислородном голодании тканей любой природы является дефицит энергии в клетках.
Гипоксия, приводящая к дефициту энергии в клетках, и сопровождающие ее процессы свободнорадикального окисления лежат в основе патогенеза широкого круга заболеваний (ишемические процессы головного мозга, сердца, печени, почек).
Выделяют несколько видов гипоксии: гиперкапническую, гипобарическую, гемическую и циркуляторную.
Острая гиперкапническая гипоксия
Для воспроизведения этой формы гипоксии животных (чаще мышей) поодиночке сажают в герметически закрывающиеся сосуды (200 см 3 ). По мере потребления О 2 животными, его концентрация в сосуде снижается, что приводит к их гибели. Регистрируют продолжительность жизни животных, по которой судят об эффективности исследуемых веществ.
Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно в течении 5-ти дней до помещения в герметичные сосуды, последнее введение осуществляют за 2 часа до помещения животных в герметичные сосуды. Мышам контрольной группы в том же объеме вводится плацебо.
Острая гемическая гипоксия
Гемическая гипоксия является одной из основных форм гипоксических состояний, лежащих в основе других смешанных форм кислородной недостаточности. В связи с неоднозначностью механизмов нарушений, лежащих в основе разных типов гипоксий, антигипоксические свойства веществ, проявляемые на одной какой-либо модели, не обязательно воспроизводятся на другой.
В основе гемической гипоксии лежит уменьшение кислородной емкости гемоглобина. Известно несколько веществ, способных переводить оксигемоглобин в метгемоглобин. Чаще других с этой целью используют натрия нитрит ( NaN О 2 ). При использовании этой модели эффективность антигипоксического действия исследуемых веществ оценивается по изменению времени жизни животных относительно контроля.
Эксперимент проводится на белых беспородных мышах самцах. Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно ежедневно в течение пяти дней. Последнее введение осуществляли за 2 часа до внутрибрюшинной инъекции натрия нитрита в дозе 200 мг/кг.
Циркуляторная гипоксия
Локальная циркуляторная гипоксия моделируется в зависимости от направленности действия того или иного исследуемого вещества.
В экспериментах используют белых беспородных крыс самцов, весом не менее 300 г. или более крупных животных.
Моделирование экспериментального инфаркта миокарда (ЭИМ) проводят перевязкой левой коронарной артерии. Под эфирным рауш-наркозом рассекают кожу и подкожную жировую клетчатку, ткани отделяют по фасции, грудные и межреберные мышцы разъединяют вдоль хода волокон. После вскрытия грудной клетки сердце выводят в операционную рану, левую коронарную артерию прошивают и перевязывают лигатурой. Контроль наступления ишемии миокарда проводят электрокардиографически. После операции рану послойно ушивают. К онтролем для животных с ишемией служат ложнооперированные животные. Для крыс, получавших вещества, контроль составляют нелеченные животные с ишемией миокарда.
О развитии ишемических нарушений судят по динамике веса тела крыс, в гомогенатах сердца оценивают содержание восстановленного глутатиона, АТФ, гликогена, активность каталазы, сукцинатдегидрогеназы, интенсивность тканевого дыхания.
В крови оценивают активность каталазы, АЛТ, АСТ, КФ, ЛДГ. Оценку ПОЛ проводят по содержанию МДА в сыворотке и гомогенате сердца.
После эвтаназии животные подвергаются патологоанатомическому вскрытию и гистологическому исследованию ткани сердца.
Исследуемые препараты вводят внутрижелудочно один раз в сутки курсом 5 дней до ЭИМ и один раз в сутки курсом 7 дней после ЭИМ. Интактным животным и животным с ЭИМ без лечения вводят плацебо.
Острую ишемию мозга вызывают билатеральной окклюзией общих сонных артерий под кратковременным эфирным наркозом. Крыс фиксируют на станке, препарируют общие сонные артерии, накладывают лигатуры, рану обрабатывают антисептиком и послойно зашивают. К онтролем для животных с ишемией служат ложнооперированные животные. Для крыс, получавших вещества, контроль составляют нелеченные животные с ишемией мозга.
Целостноcть физиологических реакций крыс на вторые c утки после перенесенной острой ишемии головного мозга оценивается в тесте «открытого поля» и «приподнятого крестообразного лабиринта» с учетом ориентировочно-исследовательского эмоционального, стереотипного и двигательного компонентов.
После эвтаназии проводятгистохимическое и гистологическое исследование мозга экспериментальных животных . Извлекают большие полушария головного мозга. Одно полушарие отделяется, измельчается и погружается в 0,5% раствор Эванса голубого, для окрашивания ишемизированных участков, далее ткань отмывают от остатков красителя не связанного с альбумином и помещают в диметилсульфоксид, в котором происходит высвобождение комплексов красителя с альбумином. Об обширности ишемического повреждения судят по интенсивности окраски раствора ДМСО, определяемой спектрофотометрически при 630 нм.
Оставшееся полушарие мозга хранят в замороженном состоянии (-80 градусов). Ткань мозга гомогенизируют и определяют в ней биохимические показатели, характеризующие энергетический обмен (содержание лактата и пирувата, АТФ, АДФ и АМФ), состояние перекисного окисления липидов (содержание малонового диальдегида) и состояние антиоксидантной системы (активность супероксиддисмутазы, содержание восстановленного глутатиона).
Публикации по теме: 1. Александрова А.Е., Макаров В.Г., Зайцева М.А., Макарова М.Н. Антиишемическая активность экстрактов из винограда культурного при экспериментальном инфаркте миокарда // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 55-60. 2. Александрова А.Е., Макарова М.Н. Антигипоксическая и антиоксидантная активность синтетических и природных препаратов // Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы. 9-10 сентября 2004. Матер. научно-практич. конференции с международным участием. –Москва. -2004. –С. 5-9. 3. Макаров В.Г., Александрова А.Е., Зайцева М.А., Макарова М.Н. Защитная активность экстрактов винограда при экспериментальном инфаркте миокарда // Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция. Материалы Четвертой Российской конференции 12-14 октября 2005., Москва. –С. 72-73. 4. Макаров В.Г., Макарова М.Н., Александрова А.Е., Селезнева А.И., Тесакова С.В. Изучение антиоксидантной и антигипоксической активности экстрактов бадана толстолистного // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения – Фитофарм. -2005, 22-25 июня: Матер. IX международного съезда. –Санкт-Петербург, Россия. –2005. –С. 94-102. 5. Макарова М.Н., Александрова А.Е., Макаров В.Г., Селезнева А.И., Тесакова С.В. Оценка антиоксидантных и антигипоксических свойств экстрактов бадана толстолистного // Гипоксия: механизмы, адаптация коррекция. Материалы Четвертой Российской конференции 12-14 октября 2005., Москва. –С. 73. 6. Рыженков В.Е., Макаров В.Г., Александрова А.Е. Гипоксия и атерогенез. Антиатерогеннные свойства некоторых средств с антигипоксическим действием // IX Междунар. съезд "Фитофарм-2005": матер. съезда. – Санкт-Петербург, 22-25 июня 2005 г. – Санкт-Петербург. – 2005. – С. 126-134. 7. Ryzhenkov V.E., Makarov V.G., Alexandrova A.E. Some aspects of the dual role of hypoxia in atherogenesis. Abstr. VIII World Congress International Society for adaptive medicine (ISAM), Russia, Moscow, June 21–24, 2006: 157.
Сердечно-сосудистая система