Антиоксидантный и антирадикальный эффекты in vivo, in vitro и in situ

Экспериментальная оценка антиоксидантной активности биологически активных веществ

В развитии многих патологических состояний важную роль играет избыточная продукция клеткой свободных радикалов, защиту от которой обеспечивает функционирование антиоксидантной системы (АОС) клетки.

При изучении антиоксидантной активности БАД целесообразно иметь в виду не только многообразие механизмов антиоксидантной активности, входящих в их состав отдельных биологически активных веществ, но и то, что роль каждого из них может существенно различаться при различных способах активации свободнорадикальных процессов, при этом они способны иметь одновременно несколько точек приложения. Механизм, который является действующим или доминирующим в конкретной ситуации, зависит от условий реакции, и определяет выраженность антиоксидантной активности.

Оценка антиоксидантной активности фармакологических веществ должна включать в себя несколько этапов:

I . Скрининг биологически активных веществ – in vitro или ex vivo на моделях с генерацией определенного радикала, как показатель антирадикальной активности.

II . Оценка антиоксидантной активности веществ в различных тканях, сыворотке крови и эритроцитах при индукции свободнорадикальной патологии, как показатель антиоксидантной активности.

Открытым до сих пор остается и вопрос о связи антиоксидантных свойств того или иного вещества с его структурой. При выборе экспериментальной модели in vitro весьма принципиальным является растворимость вещества, поскольку ряд моделей с генерацией определенного вида радикалов оказывается неприемлемым для исследуемого вещества в силу его низкой растворимости в полярных или неполярных растворителях.

Методы in vitro на моделях с генерацией активных форм кислорода

Скрининг гидрофильных биологически активных веществ

В эксперименте для регистрации образования гидроксильного радикала (ОН) используют спектрофотометрические, хроматографические и флуоресцентные методы.

1. Спектрофотометрический метод с использованием 1,3-глутариламино-5-нитробензола, который под действием гидроксильного радикала окисляется до 1,3-глутариламино-2-окси-5-нитробензола. Оценка скорости образования HO радикал осуществляется по степени деструкции 2-дезокси- D -рибозы. Для генерации гидроксильного радикала используют суспензию нейтрофилов, стимулированную зимозаном или другим стимулятором. 2-дезокси- D -рибоза подвергается атаке радикал ОН с образованием низкомолекулярных диальдегидов, концентрация которых, выявляется по реакции с тиобарбитуровой кислотой, по оптической плотности растворов при длине волны 532 нм.

2. Вариантом данного метода является генерация гидроксильного радикала в реакции Фентон, в присутствии Fe 3+ -ЭДТА комплекса, перекиси водорода и аскорбиновой кислоты. Образовавшийся гидроксильный радикал вызывает деструкцию дезоксирибозы при низких значениях рН, с образованием конечных продуктов реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Регистрация результатов проводится аналогично, по продуктам деструкции 2-дезокси- D -рибозы.

3. Метод определения гидроксильного радикала, основанный на его способности образовывать гидроксилированные производные ароматических молекул, например, образование 2,3- и 2,5-дигидроксибензойной кислоты после введения салицилатов. Анализ продуктов реакции производят методом ВЭЖХ.

4. Метод с генерацией гидроксильного радикала в реакции Фентон и регистрацией его образования по изменению интенсивности флуоресценции. Дибутират флуоресцеина гидролизуется в две стадии при участии гидролаз плазмы крови с образованием 2-(3,6,9-тригидрокси-9Н-9-ксантенил)бензойной кислоты, которая является объектом атаки НО радикалов. Под действием гидроксильных радикалов образуется хиноидная форма флуоресцеина, обладающая интенсивной флуоресценцией при l возб. 490 нм и l исп. 530 нм.

5. Еще одним флуориметрическим методом является использование терефталевой кислоты, которая при взаимодействии с гидроксильным радикалом окисляется до 2-гидрокси-терефталата, который обладает интенсивной флуоресценцией при l возб 323 . нм и l исп. 435нм.

Генерацию супероксиданион радикалов (О 2 ) в эксперименте осуществляют двумя типами методов прямыми и непрямыми. Прямые методы основаны на использовании физических способов генерации: фотолиз, радиолиз, обработка ультразвуком. В непрямых методах используются окислительно-восстановительные реакции.

1. Наиболее распространенным методом генерации супероксиданион радикала является ксантин:ксантиноксидазная реакция. Ксантиноксидаза в присутствии кислорода воздуха катализирует реакцию окисления ксантина с образованием О 2 радикал . Супероксиданион радикал, вступая в реакцию с р -нитрофенилтетразолием хлоридом, образует окрашенное в красный цвет соединение формазан с max поглощения 540 нм. В качестве индикатора в этой реакции вместо р -нитрофенилтетразолия хлорида, может быть использован цитохром С с max поглощения 550 нм.

2. Кроме того, для генерации супероксиданион радикала из кислорода используют реакции окисления НАДН и рибофлавина.

Для регистрации образованного О 2 радикал используют различные хромофоры. При этом субстанции индикатора или окисляются или восстанавливаются радикалами O 2 радикал с образованием окрашенного продукта.

Способность антиоксидантов нейтрализовать пероксид водорода ( H 2 O 2 ) оценивают в реакции с растворами молибдатов с которыми перекись водорода взаимодействует с образованием иона пероксомолибдата, при этом образуется окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм. При добавлении в инкубационную систему вещества способного нейтрализовать H 2 O 2 оптическая плотность раствора снижается пропорционально активности исследуемого вещества.

Антирадикальные свойства многих веществ во многом обусловлены их способностью к легкой отдаче электронов, в связи, с чем оценка восстанавливающей способности исследуемых соединений является одним из широко распространенных методов оценки антиоксидантной активности. Оценка восстанавливающей активности тех или иных соединений может проводиться по отношению к специфическим радикалам ( ABTS радикал + и DPPH ), а также по неспецифическому восстановлению тех или иных субстратов.

К безсубстратным методам определения антирадикальной активности относят методы, основанные на использовании ABTS радикал + и DPPH радикалов.

Использование дифенилпикрилгидразил ( DPPH ) радикала . DPPH радикал имеет max поглощения на 517 нм. В присутствии донора водорода 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил восстанавливается с утратой специфической окраски.

Использование ABTS •+ радикала .

Методы основаны на ингибировании образования ABTS радикал + радикального катиона без вовлечения субстрата. ABTS (2,2'-азинобис(3-этилбензотиазолин 6-сульфонат) имеет max поглощения на 342 нм, хорошо растворим в воде и химически стабилен. Это – субстрат для пероксидазы, который может окисляться в присутствии H 2 О 2 с образованием метастабильного радикального катиона с характерным спектром поглощения и высокой оптической плотностью на 660, 734 и 820 нм. Предложено два метода по оценке ингибирования ABTS радикал + .

1. Формирование ABTS радикал + протекает под действием коммерческой пероксидазы, при этом субстрат окисляется в присутствии H 2 О 2 с образованием стабильного радикального катиона.

2. Другой вариант базируется на формировании ABTS радикал + при взаимодействии ABTS с радикалом феррилмиоглобина, которому он отдает электрон, с дальнейшим образованием метмиоглобина и перекиси водорода. Антиоксиданты подавляют образование радикального катиона и снижают оптическую плотность исследуемого раствора при лямбда = 734 нм. При этом антиоксиданты нейтрализуют непосредственно радикальный катион, а не его образование, через нейтрализацию феррилмиоглобина или перекиси водорода.

Железо-восстанавливающая активность ( FRAP ).

Метод основан на восстановлении Fe 3+ в Fe 2+ . Для этой цели предложено несколько различных соединений, имеющих в своей структуре этот ион.

1. Метод базируется на восстановлении Fe 3+ в комплексе трипиридилтриазина Fe ( TPTZ ) 3+ до окрашенного в синий цвет комплекса Fe ( TPTZ ) 2+ в присутствии антиоксиданта с восстанавливающими свойствами в кислой среде. Регистрация результатов проводится по увеличению оптической плотности лямбда = 593 нм.

2. Оценка восстанавливающей активности в реакции восстановления калия феррицианида. Калия гексаферрицианид K 3 [ Fe 3+ ( CN ) 6 ], в присутствии вещества обладающего восстанавливающими свойствами, восстанавливается до K 4 [ Fe 2+ ( CN ) 6 ], взаимодействие которого с окисленной формой Fe 2+ приводит к образованию окрашенного в синий цвет соединения Fe 4 [ Fe ( CN ) 6 ] 3 . Изменение оптической плотности осуществляют при лямбда = 700 нм .

Оценка восстанавливающей активности в реакции восстановления цитохрома С.

Коммерческий препарат цитохрома С, представляет собой, ферментный препарат, получаемый путем экстракции из ткани сердца крупного рогатого скота и свиней. Оптическая плотность раствора цитохрома С ( лямбда = 550 нм) отражает состояние активного центра фермента, содержащего ион железа: коэффициент молярной экстинкции окисленной формы составляет 8400 моль -1 *л*см -1 , а коэффициент молярной экстинкции восстановленной формы составляет 29500 моль -1 *л*см -1 . Подобные изменения в спектральных характеристиках цитохрома С позволяют оценить восстанавливающую активность исследуемого образца.

Амперометрическое определение восстанавливающей активности образцов

Определение осуществляется на хроматографе с амперометрическим детектором и заключается в измерении электрического тока в ячейке, возникающего при окислении анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода при подаче на него потенциала определенного значения. Измерение производится при постоянной величине потенциала на рабочем электроде (+1,3 В). Изменение электрического тока в ячейке в течение времени обрабатываются при помощи программного обеспечения, при этом регистрируют площадь под пиком (нА*с). Предел допускаемого значения относительного среднеквадратичного отклонения должен составлять не более 5%.

Скрининг липофильных биологически активных веществ

Пероксидные радикалы (ROO ) . Образуются при взаимодействии О 2 с органическими радикалами. Например, липидный пероксил радикал LOO . Более низкая окислительная способность по сравнению с HO радикал , но более высокая диффузия.

Алкоксильные радикалы (RO). При взаимодействии с липидами промежуточная форма между ROO радикал и HO радикал. Например, липидный радикал LO радикал индуцирует ПОЛ, обладает цитотоксическим и канцерогенным действием.

Современные знания механизма реакций цепного окисления липидов в большой мере связаны с открытием так называемого “сверхслабого свечения” хемилюминесценции (ХЛ), которое сопровождает эти реакции. При изучении кинетики хемилюминесценции обнаружился тесный параллелизм между скоростью реакции перекисного окисления липидов и интенсивностью хемилюминесценции.

Будучи прямым биофизическим методом определения липидных радикалов в мембранных системах клеток, метод ХЛ оказался адекватным и для определения уровня антиоксидантов в биологическом материале и антиоксидантной активности веществ.

В экспериментах in vitro используют различные инициаторы перекисного окисления липидов:

•  металлы переменной валентности,

•  альфа , альфа ' азо-бис(изобутиронитрил);

•  2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид;

•  2,2'-азобис(2,4-диметилвалеронитрил);

•  2,2'-азобис(2,4-диметил-4-метоксивалеронитрил).

Регистрация образования продуктов перекисного окисления липидов базируется в основном на определении концентрации гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида (и др. продуктов реагирующих с 2'-тиобарбитуровой кислотой), а также конечных продуктов окисления липидов.

1. Перекиси липидов.

Этот параметр отражает общее содержание гидроперекисей и содержание кислорода в перекиси липидов. Поскольку гидроперекиси - первичные продукты ПОЛ и играют центральную роль в дальнейшем аутоокислении липидов, изучение влияния антиоксидантов на образование гидроперекисей может рассматриваться как важнейший метод оценки антиоксидантной или антирадикальной активности того или другого антиоксиданта.

а) Одним из методов определения перекисей является иодометрическое титрование, в основе которого лежит определение свободного йода, образующегося в результате стехиометрического восстановления пероксидных групп иодид-ионом. Количество выделившегося свободного йода или трииодид иона определяют спектрофотометрически, измеряя поглощение при лямбда = 380 нм, либо титруя йод раствором тиосульфата (прямое титрование).

б) Модификацией этого метода является спектрофотометрическое определение гидроперекисей липидов, при этом высокое значение коэффициента молярной экстинкции трийод иона ( лямбда max = 290 и 360 нм) обеспечивает высокую чувствительность метода, однако не избавляет от низкой селективности.

в) Железо-тиоцианатный метод (тиоцианат анион) – гидроперекиси липидов определяют по индукционному периоду окисления линолевой кислоты. О накоплении перекисей липидов судят по изменению оптической плотности ( лямбда = 500 нм) за счет образования тиоцианатного комплекса железа(III).

2. Диеновые конъюгаты

Определение диеновых конъюгатов имеет значительное преимущество для оценки ПОЛ, поскольку отражает раннюю стадию окисления. Обычным субстратом для определения диеновых конъюгатов выступает любое вещество, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.

Диеновые конъюгаты обладают поглощением в УФ-области ( лямбда = 232 нм), коэффициент молярной экстинкции 21-24*10 3 М -1 см -1 . Пробоподготовка для анализа диеновых конъюгатов обязательно включает в себя экстрагирование липидов органическими растворителями.

а) Экстракция диеновых конъюгатов из сыворотки крови или ткани гептан-изопропанольной смесью, с последующим измерением оптической плотности в гептановой или изопропанольной фазе ( лямбда = 232-234 нм).

б) При анализе с использованием ВЭЖХ, установлено, что диеновые конъюгаты, образующиеся в организме человека, в основном представлены изомерами линолевой кислоты, октодека-9 ( цис ),11( транс )-диеновой кислоты.

3. Продукты гомолитического распада, реагирующие с 2'-тиобарбитуровой кислотой (тбк-рп).

Субстратом для данной реакции является малоновый диальдегид (МДА) и другие низкомолекулярные диальдегиды, который образуется в результате разрушения эндопероксидов полиненасыщенных жирных кислот.

МДА реагирует с 2'-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), с образованием розового продукта с max поглощения 532-535 нм при рН менее 3 и нагревании (80-100 градусов ).

На сегодняшний день для этой модели используются разнообразные субстраты, включая биологические ткани и жидкости, линолевую и другие жирные кислоты, а также ЛПНП. Для запуска ПОЛ используют любые доступные инициаторы ( Fe 2+ , Cu 2+ , AAPH , AMVN и пр.).

Для количественной оценки образовавшихся диальдегидов используются различные инструментальные методы.

а) Спектрофотометрический метод основан на определении оптической плотности образовавшегося хромогенного комплекса с 2'-тиобарбитуровой кислотой ( лямбда = 532-535 нм). Также для этого метода предложены различные варианты пробоподготовки:

•  определение МДА в нативной плазме крови, разделение водной и липидной фаз сыворотки крови достигается центрифугированием при 3000 об/мин, для дальнейшего определения используют супернатант;

•  в гомогенате печени, после осаждения белков фосфорновольфрамовой кислотой;

•  определение МДА в бутанольной фракции, где оптическую плотность хромогенного комплекса измеряют на двух длинах волн (535 и 580 нм), чтобы избежать мутности образцов.

б) Метод ВЭЖХ позволяет определять непосредственно сам МДА в сыворотке крови, однако данный метод требует предварительного гидролиза связанного МДА из его комплексов.

в) Флуориметрические методы для определения МДА, например, определение МДА-ТБК комплекса при l возб. 515 нм и l исп. 554 нм. Для образования флуоресцентных комплексов с МДА можно использовать 4,4-сульфонилдианилин, этил- p -аминобензоат, p - аминобензойную кислоту, 4-аминоацетофенон.

г) Еще один метод для оценки ПОЛ так называемый ПОЛ-586 исследование. Этот метод позволяет определить МДА и 4-гидроксиалкенали, но не специфичен для этих групп. Хромофор, образуется за счет конденсации альдегидов с N -метил-2-фенилиндолом, и обладает поглощением ( лямбда = 586 нм). Метод может использоваться как альтернатива для метода определения ТБК-РП.