Диагностика нарушений белкового обмена

Способы определения общего белка

        Азотометрические (метод Кьельдаля) — полное разрушение белка серной кислотой → определение содержания аммиака. Недостатки — трудоемкость, низкая точность.

        Основанные на определении плотности сыворотки крови (способом падающей капли) — неточны, т.к. плотность зависит от содержания не только белков, но и других веществ, находящихся в плазме.

        Гравиметрические (весовые) — осаждение белков, высушивание, взвешивание. Недостатки — трудоемкость, низкая точность.

        Нефелометрические, поляриметрические методы — из-за недостаточно высокой специфичности, чувствительности и других причин не получили широкого распространения в клинико-лабораторной практике.

        Флуориметрические — включение в структуру белка или полипептида флуорогенной метки (флуоресцамин) → измерение интенсивности флуоресценции при возбуждении светом. Высокая чувствительность (до 1 мг/л).

        Спектрофотометрические: Фотометрия в ультрафиолетовом диапазоне (λ =280нм). Поглощение обусловлено присутствием аминокислот тирозина, трипотофана, фенилаланина. Интерференция — нуклеиновые кислоты (адсорбируют на 280нм), рН (надо щелочную), мутность раствора. 

        Колориметрические:

§        Биуретовая реакция — в щелочной среде ионы меди образуют с белками (и пептидами) комплексы фиолетового цвета, измерение 500-560 нм. Хорошо воспроизводим, специфичен, доступен. Унифицирован. Чувствительность до 300 мг/л. Интерференция – высокая концентрация билирубина, триглицериды, избыток CO₂. Большинство лекарств интерференцию не вызывают.

§        Биуретовый метод Лоури — биуретовая реакция + реакция Фолина (восстановление комплекса молибдат-вольфрамат-фосфорная кислота)  тирозином и триптофаном белка. Чувствительность ↑ в 100 раз. Недостаток — невысокая специфичность. Интерференция — мочевая кислота, аминокислоты, ксантин, фенолы, углеводы, салицилаты, антибиотики, продукты ПОЛ, вещества, входящие в буферы). Применение — научные исследования.

        Методы, основанные на неспецифическом связывании белков с красителями: амидо черный, бромкрезоловый зеленый, тимоловый синий, бромсульфалеин, Кумасси бриллиантовый синий  и др.). Кумасси — не выявляет олигопептиды и свободные аминокислоты.

 

Методы определения уровня альбумина в сыворотке крови

        Высаливание глобулинов (сульфат натрия, сульфат аммония, этанольный раствор ТХУ) → определение альбумина в надосадочной жидкости по реакции с биуретовым реактивом или с реактивом Фолина.

        Электрофоретическое фракционирование – на ацетатцеллюлозных пленках, агаровом, полиакриламидном геле, хроматографической бумаге и т.д.

        Хроматографическое разделение.

        Гельфильтрация.

        Иммунохимическое определение

        Прямое колориметрическое определение — сыворотка +бромкрезоловый зеленый РН 4,2 — зелено-голубое окрашивание → фотометрия λ 580-630 нм. Высокая специфичность и чувствительность.

        Флуориметрическое определение.