Основы иммунологии

3.Определяют содержание Т-хелперов и Т-супрессоров с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тc) антигенам.

У человека в норме в крови обнаруживается 33-46% Тx, 17-25% Тc, соотношение Тx/Тc=1,4-2.0 – иммунорегуляторный индекс. При заболеваниях этот индекс изменяется. Например, при СПИДе он уменьшается (0,04), т.к. угнетаются Тx (рецептором для вируса СПИДа является антиген Тx СD4). При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2.0.

4.Для выявления активированных Т-клеток определяют рецепторы к ИЛ-2 (CD25), HLA-DR антигены и CD71 (рецептор для трансферрина).

5.Определяют уровень различных цитокинов в крови (обычно с помощью иммуноферментного анализа).

Исследуют также функциональные показатели Т-лимфоцитов: пролиферативную активность (см. РБТЛ, РПМЛ), цитотоксическую и цитокиновую активность. Показатели Т-лимфоцитов снижаются при Т-клеточных иммунодефицитах.

Характеристика В-лимфоцитов

1.Общее количество В-лимфоцитов можно определить с помощью моноклональных антител к антигенам СD19-СD22, СD72. Применяют также антитела к иммуноглобулинам, которые находятся

на поверхности В-лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 17-25% всех лимфоцитов (600-800 клеток в 1 мм3 крови). Иногда определяют В-лимфоциты, имеющие рецепторы к эритроцитам мыши (10-15%), составляющие лишь часть В-субпопуляции.

2.Продукты В-лимфоцитов – иммуноглобулины G, М, A классов

всыворотке крови и различных биологических жидкостях определяют с помощью радиальной иммунодиффузии в агаре – реакции преципитации по Манчини.

Для этого на одну стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают 2% агар, смешанный с антителами против IgG; на вторую пластинку – с антителами против IgМ, на 3-ю – против IgА. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок каждой пластины вносят стандартную сыворотку с известной концентрацией IgG, IgМ, IgА. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных.

121

Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови (рис. 5.1). Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и

122

определяют концентрацию иммуноглобулина. Для определения секреторного IgA (в слюне и др.) используют аналогичный метод в двух вариантах: определяют IgA ( -цепь) и его секреторный компонент с помощью соответствующих антител.

Нормы у взрослых: 0,8-2 г/л IgM; 8,0-13,0 г/л IgG; 1,4-3,0 г/л IgA.

У новорожденных уровень IgG близок к материнскому, IgM и IgA имеются в следовых концентрациях; к 4-6 мес. уровень IgG падает до 5-6 г/л, а затем увеличивается. При нормальном развитии детей уровень иммуноглобулинов к 2-м годам близок величинам их у взрослых.

Уровень секреторного IgA в слюне составляет 0,03-0,4 г/л.

При иммунодефицитах уровень иммуноглобулинов снижается (гипогаммаглобулинемия), а при стимуляции СИ и воспалении – повышается (гипергаммаглобулинемия).

Определяют уровень естественных (против антигенов групп крови, эритроцитов животных и др.) и иммунных (к распространенным бактериальным и вирусным антигенам, вакцинам) антител. Он снижен (или антитела отсутствуют) при иммунодефицитах

Характеристика системы гранулоцитов и моноцитов

1.Определяют количество лейкоцитов в крови и соотношение их видов (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты).

2.Оценивают поглотительную и переваривающую активность фагоцитов: к взвеси лейкоцитов или капле крови добавляют взвесь

отмытой суточной культуры стафилококков. Готовят 3 пробы, инкубируют при 370С 1-ю пробу 45 мин, 2-ю - 60 мин, 3-ю - 90 мин. Делают мазки, высушивают их, фиксируют этанолом и окрашивают по Романовскому.

Определяют фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. Фагоцитарное число – это среднее количество частиц или

микроорганизмов в одном фагоците (норма для стафилококков 6-12, кандид – 2-4).

Фагоцитарный индекс – это количество фагоцитов, участвующих

вфагоцитозе, имеющих поглощенные частицы (норма – 60-80%). Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет

оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с

123

перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется.

Переваривание микробов можно оценивать путем посева лизатов лейкоцитов (после инкубации с микробами) на питательные среды и подсчета выросших колоний. Метод предполагает использование в качестве объекта фагоцитоза живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами (см. выше) фагоциты осаждают центрифугированием, отмывают и лизируют. Их лизаты высевают на твердую питательную среду. Переваривающую активность фагоцитов оценивают по числу выросших колоний.

Метаболическую активность фагоцитов определяют в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) после окраски их 0.25% раствором данного красителя. В норме нитросиний тетразолий окрашивает (диффузно и в виде глыбок голубого цвета) 15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40% и более.

Показатели фагоцитов снижаются при соответствующих иммунодефицитах, а повышаются при благоприятном течении инфекции.

3.На фагоцитах с помощью моноклональных антител определяют антигены дифференцировки, активации и адгезии (СD14,

СD11, СD18, HLA-DR и др.)

4.Выявляют рецепторы к С3 компоненту комплемента, к иммуноглобулинам и др.

5.Оценивают спонтанную и направленную миграцию (хемотаксис).

6.Определяют способность секретировать цитокины (ИЛ-1,

ФНО и др.) и их уровень в крови.

Характеристика системы комплемента

1. Определяют гемолитическую активность комплемента в реакции гемолиза с использованием гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической сывороткой.

Определение комплемента основано на способности продуктов его активации вызывать лизис эритроцитов, покрытых антителами. По степени гемолиза судят о гемолитической активности комплемента.

124

В качестве единицы измерения комплемента используется гемолитическая единица (СН50) – количество комплемента, вызывающее 50%-ный лизис 3% суспензии сенсибилизированных антителами эритроцитов при температуре 370С в течение 45 мин. Титрование комплемента сводится к определению количества СН50 гемолитических единиц в конкретном объеме сыворотки. Для этого к различным дозам сыворотки прибавляют стандартное количество сенсибилизированных эритроцитов. Затем, используя шкалу лизиса эритроцитов дистиллированной водой, находят количество СН50 единиц.

Степень гемолиза при титровании комплемента можно определять фотометрическими методами (с помощью спектрофотометра, фотоколориметра, нефелометра) или же визуально путем сравнения интенсивности гемолиза в опытных пробирках со стандартной шкалой лизированных эритроцитов.

2. Выявляют продукты активации С4а, С3а, С5а и др.

Специфические показатели иммунного статуса

Для оценки специфических показателей используют 3 группы методов:

1.Методы определения антител различных классов (G, М, А, Е) к определенным антигенам.

2.Методы выявления иммунных Т-лимфоцитов, несущих рецепторы к определенному антигену.

3.Методы обнаружения антигенов.

Эти методы основаны на иммунных реакциях, которые ставят в лабораторных условиях. Есть 2 группы реакций: серологические (основаны на взаимодействии антигенов и антител) и клеточные, базирующиеся на взаимодействии антигенов (аллергенов) с Т- клетками.

125

Серологические реакции для выявления антигенов и антител

Данная группа иммунологических реакций оказалась исключительно удобной, как для исследования любых сложных смесей антигенов, так и для обнаружения антител к ним.

Первоначально эти реакции были использованы для диагностики инфекционных болезней, а также в микробиологической практике.

Высокая чувствительность и специфичность серологических реакций обусловили их широкое применение в биологии и медицине.

Эти реакции можно охарактеризовать как процесс взаимодействия антигенов с антителами, протекающий in vitro и имеющий ряд особенностей: потребность в электролитах, обратимость, двухфазность. Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с pH, близким к нейтральному при t – 37 С. Связь между антигеном и антителом в образовавшемся комплексе прочная, но обратимая. Комплексы антиген-антитело могут диссоциировать на составные компоненты без изменения свойств. Диссоциация усиливается при снижении pH до 2-3 и повышении pH до 9.0 и более.

Реакции протекают в две фазы:

1)специфическая – фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител и эпитопов антигена; обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;

2)неспецифическая – фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов; может развиваться от нескольких минут до нескольких часов (в среднем – 30 мин).

Реакции антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов –

агглютинации, преципитации, лизиса. Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размеры частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, pH, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и

антидетерминантами. В результате формируются сетевые решетчатые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антииммуноглобулинов (см. реакцию Кумбса).

В серологических реакциях обычно решается две задачи:

1)с помощью известной антисыворотки в биологических жидкостях выявляют антиген;

2)с помощью известного антигена в сыворотке крови определяют антитела.

Для выявления неизвестного антигена (микроорганизма, белка и др.) используют диагностические иммунные антисыворотки,

которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами.

Обнаружение антител проводят с использованием специальных

антигенов – иммунодиагностикумов. Часто это взвесь известных убитых (инактивированных) микроорганизмов. При выделении из клеток различных антигенов используют методы разрушения, экстракции, обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирование.

Реакции агглютинации

Вэтих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Взависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации и т.д.

Для диагностики инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух вариантах: определяют вид

выделенного от больного микроба-возбудителя с помощью

127

диагностической агглютинирующей сыворотки (серологическая идентификация микроба) и выявляют антитела в сыворотке больного, используя стандартный микробный диагностикум

(серодиагностика заболевания, постановка серологического диагноза).

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены). Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации). По характеру образующегося агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О-антиген. Бактерии, имеющие жгутики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

Для определения вида микроорганизмов используют

стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки. Их получают гипериммунизацией лабораторных животных взвесью бактерий определенного вида. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация данной бактериальной культуры. Однако из-за сложности антигенной структуры бактерий, агглютинирующие сыворотки содержат антитела не только к видоспецифическим, но и к групповым антигенам и могут давать групповую агглютинацию с родственными видами бактерий. Титры антител к видоспецифическим антигенам в сыворотке всегда выше, чем к групповым. Для удаления группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким методом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микроба.

Варианты реакций агглютинации.

Наиболее распространенными являются пластинчатая РА на стекле и развернутая РА в пробирках или планшетах.

В пластинчатой РА используют сыворотки с небольшим разведением или неразведенные. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов. На стекло наносят каплю сыворотки, в которую петлей вносят

128

неизвестную культуру бактерий, перемешивают и через 2-3 минуты наблюдают появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации. Для контроля используют каплю физиологического раствора, в которой после внесения бактерий наблюдается помутнение. При использовании неадсорбированных сывороток реакция на стекле имеет только ориентировочное значение. Адсорбированные сыворотки позволяют сразу провести идентификацию микроорганизмов.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках планшетов. При этом диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок в виде "зонтика", при отрицательном – осадок в виде "пуговицы". Поскольку титры группоспецифических антител в сыворотке значительно ниже, чем титр видоспецифических, групповые реакции наблюдаются лишь в небольших разведениях сыворотки. Если агглютинация происходит до титра или до половины титра сыворотки, она является видоспецифической.

Для определения антител в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум, содержащий взвесь известных микробов или их антигенов. В этом случае также можно ставить пластинчатую и развернутую РА.

Реакция прямой агглютинации клеток.

Для определения групп крови используют стандартные сыворотки 0, А, В групп с титром >1:32 и контрольную АВ (IV) группы. При 1825°С на планшет (тарелку) наносят по одной–две капли этих антисывороток, добавляют к ним в 8-10 раз меньшие капли крови из пальца или из пробирки и смешивают палочкой; осторожно покачивают в течение 3 мин. При наличии агглютинации, добавляют по 1 капле 0,9% раствора хлорида натрия и учитывают результат через 5 мин. При отсутствии агглютинации во всех трех смесях – нет антигена (0, I гр); если агглютинация с сывороткой 0 (I) и В (III), то имеется антиген А – группа А (II); если агглютинации в сыворотке 0

(I) и А (II), то имеется антиген В – группа В (III), наличие агглютинации во всех трех пробах при отсутствии в контрольной – АВ указывает на присутствие антигенов А и В – группа АВ (IV).

Применяется также проба на совместимость крови, когда капли крови донора и реципиента смешивают и оценивают агглютинацию.

129

Впоследнее время для определения групп крови используют моноклональные антитела с высокой активностью и специфичностью.

Вклиниках применяют реакции агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и других клеток для выявления аутоантител, а также для определения антигенов на этих клетках.

Реакция непрямой (пассивной) агглютинации.

Для получения феномена агглютинации антиген предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистирол, оксид бария и др.) или клетки (эритроциты барана, I(0)-группы крови человека).

Антитело

Антиген –

Инертная частица – (эритроцит, латекс и т.д.)

Рис 5.2. Реакция пассивной агглютинации

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок (рис. 5.2). Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный антигенный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика, установление серологического диагноза). Если нагрузить эритроциты антителами, то их можно применять для выявления антигенов.

130