Внимание: Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированной азотной кислотой
ХОД РАБОТЫ: В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1- яичного белка, во 2 - желатина, в 3 - миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. В первой пробирке образуется осадок желтого цвета, а во второй - слабое окрашивание, т.к. желатин не содержит циклических аминокислот. В 3-ей пробирке образуется осадок белого цвета, переходящий в желтый цвет. Пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 10-15 капель 20% едкого натра до изменения окраски растворов, вследствие образования натриевой соли динитротирозина.
Реакция на тирозин (Миллона).
ПРИНЦИП МЕТОДА: основан на образовании осадка ртутной соли динитротирозина кроваво-красного цвета.
ВНИМАНИЕ: Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Миллона (содержит Hg и HNO3)
ХОД РАБОТЫ: В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1- яичного белка, во 2 - желатина, в 3 - миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капель реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте) и осторожно нагревают. Отмечают изменение цвета в пробирках, характеризующее наличие в указанных белках тирозина.
Реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу).
ПРИНЦИП МЕТОДА: основан на щелочном гидролизе белка и последующем отщеплении серы -SH групп в виде сульфида свинца (PbS) черно-бурого цвета.
ВНИМАНИЕ: Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Фоля (содержит NaOH и PbS)
ХОД РАБОТЫ: В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1- яичного белка, во 2 - желатина, в 3 - миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Фоля. Затем интенсивно кипятят и дают постоять 1-2 мин. При этом в 1 и в 3 пробирках образуется черный или бурый осадок сульфида свинца. Желатин осадка не образует, т.к. не содержит серосодержащих аминокислот.
Лабораторная работа №2. Определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.
ПРИНЦИП МЕТОДА: В основе рефрактометрии лежит различная преломляющая способность жидких сред, количественно выражаемая коэффициентом преломления (отношение синуса угла падения () к синусу угла преломления ():
Sin
n = ,
Sin
который в сыворотке крови обусловлен в основном количеством, качеством растворенного белка и температурой. Влияние других компонентам сыворотки крови на коэффициент преломления значительно меньше. Определение коэффициента преломления проводят с помощью рефрактометров.
РАСЧЕТ: Определив показатель преломления по таблице, вычисляют процент содержания белка в сыворотке крови, для перехода к единицам системы СИ (г/л), результат следует умножить на 10.
НОРМА: содержание общего белка в плазме (сыворотке) крови здорового человека составляет 6.5-8.5 % или 65-85 г/л.
►6) Количественное определение мочевины в сыворотке крови и в моче.
ПРИНЦИП МЕТОДА: Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа комплекс красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины.
ХОД РАБОТЫ осуществляется в соответствии с таблицей (1):
В пробирку отмеривают 0,01 мл сыворотки крови или разведенной мочи, добавляют 2 мл рабочего раствора (реактива 2) содержащего смесь раствор диацетилмонооксима, тиосемикарбазида и хлорида железа в кислой среде.
Эталонную пробу обрабатывают точно также, используя вместо 0,01 мл сыворотки крови 0,01 мл эталонного раствора мочевины (реактива 1).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, пробирки закрывают алюминиевой фольгой и помещают точно (!) на 10 минут в кипящую баню.
Затем пробирки быстро охлаждают в токе холодной воды и не позднее 15 мин. (!) после охлаждения, измеряют оптическую плотность пробы (A1) и эталона (A2) против контрольного раствора (реактив 2) в кювете 10 мм при длине волны 490-540 нм (зеленый светофильтр).
Мочу перед анализом разводят дистиллированной водой в соотношении 1:100, а результат умножается на коэффициент разведения.
РАСЧЕТ:
A1
[Мочевина] = 16,65 (ммоль/л)
A2
НОРМА: составляет 2.5 - 8.3 ммоль/л
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
При содержании мочевины в пробе свыше 23 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой, анализ провести повторно, а полученный результат умножить на коэффициент разведения.
При определении мочевины в гемолитических или липемических сыворотках пробу необходимо депротеинировать, 5% раствором ТХУ.
Для этого в пробирке смешивают 0,1 мл пробы с 1 мл раствора ТХУ и центрифугируют. Точно также разбавляют и эталонный раствор мочевины. Для собственно анализа отмеривают 0,1 мл надосадочной жидкости. Далее определение проводят как при анализе без депротеинирования. Таким же способом можно анализировать цельную кровь.