►1) Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

ХОД РАБОТЫ: Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи (см. табл.).

В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. После перемешивания содержимого, пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45°С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу:

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

►2) ХЗ, ЧТО ЭТО!!! НАВЕРНОЕ, ОТ РУКИ ПИСАЛИ…((

►3) Эмульгирование жира.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Эмульгирование жира различными амфифильными веществами происходит благодаря их адсорбции на границе раздела двух фаз - гидрофобной и гидрофильной.

ХОД РАБОТЫ: В пять пробирок вносят по 1 капле растительного масла. Затем в каждую пробирку соответственно приливают по 1-2 капли растворов NaOH, NaHCO₃, яичного белка, моющего средства и желчи. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и наблюдают образование эмульсии жира. Объясните механизм образования эмульсии жира в этих растворах и значение процесса эмульгирования.

►4) Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной пробе желудочного сока.

ПРИНЦИП МЕТОДА: основан на титровании желудочного содержимого раствором 0.1н NaOH в присутствии индикаторов с различными зонами перехода. Кислотность желудочного сока выражают количеством ммоль едкого натра, нейтрализующего 1 л желудочного сока.

Основные фракции кислот желудочного сока.

“общая кислотность” желудочного сока это сумма всех кислот желудочного содержимого,

“свободная соляная кислота” - свободная минеральная HCl,

“связанная соляная кислота” - кисло реагирующие соли (хлориды) белков и других слабых оснований,

“общая соляная кислота” - сумма свободной и связанной HCl.

Количественное определение свободной соляной кислоты.

Свободная соляная кислота оттитровывается раствором 0.1н NaOH в присутствии индикатора диметиламиноазобензола, имеющего зону перехода окраски от красной до оранжевой при pH 3.0. Слабые же кислоты (молочная, уксусная кислота, кислые фосфаты и связанная соляная кислота) при pH 2.9 - 4.0 находятся в растворе в недиссоциированном состоянии и в реакцию со щелочью не вступают.

ХОД РАБОТЫ: К 10 мл желудочного сока добавить 1-2 капли спиртового раствора диметиламиноазобензола и титровать раствором 0.1н NaOH до появления оранжевой окраски.

Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока. Так как затраченное на титрование количество едкого натра эквивалентно количеству соляной кислоты в пробе желудочного сока, то количество соляной кислоты в 1 л желудочного сока будет равно:

a  0.1  1000

X =  ммоль/л, (1)

b

где: а - количество (мл) 0.1н раствора NaOH, затраченное на титрование,

0.1 - количество (ммоль) NaOH в 1 мл 0.1 N раствора,

b - количество (мл) желудочного сока, взятого для титрования,

1000 - объем (мл) желудочного сока.

Количественное определение общей кислотности желудочного сока.

Титрование общей кислотности желудочного сока проводится раствором 0.1н NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина с зоной перехода окраски в пределах pH 8.2 - 10.0, при pH ниже 8.2 он бесцветный, а при pH выше 10.0 - красный.

ХОД РАБОТЫ: К 10 мл профильтрованного желудочного сока добавить 1-2 капли раствора фенолфталеина и титровать 0.1н раствора NaOH до появления слабо розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Произвести расчет на 1000 мл желудочного сока.

Количественное определение общей кислотности, общей, свободной и связанной соляной кислоты в одной порции желудочного сока.

ХОД РАБОТЫ: Отмерить в колбочки по 10 мл желудочного сока и добавить по 1-2 капли диметиламиноазобензола и фенолфталеина. Титровать 0.1н раствором NaOH до появления оранжевого окрашивания (первая отметка количества израсходованного 0.1н раствора NaOH). Затем продолжить титрования до лимонно-желтого цвета (вторая отметка) и, наконец, до розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин (третья отметка).

В процессе титрования отсчет ведется от начальной точки!

Первая отметка соответствует количеству свободной соляной кислоты, третья - общей кислотности. Вторая отметка используется для расчета количества общей соляной кислоты. Среднее арифметическое между вторым и третьим пунктом соответствует общей соляной кислоте. Количество связанной соляной кислоты вычисляется как разница между общей и свободной соляной кислотой.

Например, при титровании 0,1н раствором едкого натра затрачено титрованного раствора (с начала титрования): до первой отметки (оранжевый цвет) 3,3 мл, до второй (лимонно-желтый цвет) - 4,6, до третьей (розовый цвет) - 5,6 мл. Среднее между второй и третьей отметкой:

4.6 + 5.6

 = 5.1 мл

2

Произвести расчет содержания свободной соляной кислоты, общей соляной кислоты, общей кислотности на 1000 мл желудочного сока по формуле (1).

Этот способ расчета неприменим при наличии молочной кислоты в желудке. Поэтому в пробах желудочного сока, содержащего молочную кислоту ограничиться вычислением свободной соляной кислоты и общей кислотности.

НОРМА: Показатели кислотности профильтрованного желудочного содержимого взрослого человека после стандартного пробного завтрака составляют:

• общая кислотность 40 - 60 ммоль/л

(новорожденные 2.8 ммоль/л; дети до года 4-20 ммоль/л)

• свободная HCl 20 - 40 ммоль/л (новорожденные 0.5 ммоль/л)

• связанная HCl 10 - 20 ммоль/л

• общая HCl 30 - 60 ммоль/л