Определение групповой принадлежности крови с использованием антител

Определение группы крови можно произвести с помощью моноклональных антител (МКА). Для определения агглютиногенов эритроцитов используют стандартные реагенты цоликлоны анти-А и анти-В. Получают моноклональные антитела с применением гибридомной битехнологии. Гибридома – это клеточный гибрид, возникший в результате слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих “родителей”: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту. Цоликлоны анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами. Они предназначены для определения группы крови системы АВО человека взамен стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Цоликлоны анти-А (красного цвета) и анти-В (синего цвета) выпускаются как в нативной, так и в лиофилизированной форме в ампулах по 20,50,100,200 доз с растворителем, приложенным к каждой ампуле по 2,5, 10,20 мл соответственно. Лиофилизированный порошок разводят изотоническим раствором хлористого натрия непосредственно перед исследованием. Для каждого определения группы крови применяют по одной серии реагента анти-А и анти-В.

Материальное оснащение: цоликлоны анти-А и анти-В, изотонический раствор хлорида натрия, иглы, тарелки, стеклянные палочки или предметные стекла, пипетки, песочные часы, резиновые перчатки, маска, очки, клеенчатый передник.

Методика выполнения:

1. Надеть маску и передник, обработать руки антисептиком для обработки рук, надеть перчатки и защитные очки.

2. Убедиться в пригодности цоликлонов, донорской крови.

3. На тарелке написать Ф. И. О. донора и реципиента.

4. Вскрыть ампулы с цоликлонами, растворителями, смешать все с помощью отдельных шприцев, разлить цоликлоны во флаконы с пипеткой (анти-А – красный, анти-В – синий).

5. Взять кровь реципиента и донора.

6. В две лунки под соответствующими надписями: анти-А или анти-В нанести по 1 капле (0,1мл) цоликлонов: в первую – цоликлон анти-А, во вторую – цоликлон анти-В.

7. Отдельным концом стеклянной палочки или отдельной пипеткой для каждой лунки перенести каплю крови в 10 раз меньше капли цоликлона с предметного стекла в лунку и смешать с каплей цоликлона до гомогенного пятна.

8. Блюдце осторожно покачивать в течение 2,5 мин.

9. Оценить результат пробы без добавления изотонического раствора натрия хлорида.

Оценка результатов:

• При отсутствии агглютинации с двумя цоликлонаи группа крови 0(I) – первая.

• При наличии агглютинации с цоликлоном анти-А группа крови А(II) – вторая.

• При наличии агглютинации с цоликлоном анти-В группа крови В(III) – третья.

• При наличии агглютинации с двумя цоликлонами группа крови АВ(IV) – четвертая.

ОШИБКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППОВОЙ

ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ

Ошибки при определении групповой принадлежности крови могут быть обусловлены тремя видами причин:

• техническими;

• неполноценностью стандартных сывороток и стандартных эритроцитов;

• особенностями испытуемой крови.

Технические причины:

• нарушение порядка расположения сывороток на планшете;

• нарушение соотношения сыворотки и эритроцитов;

• несоблюдение внешних условий (плохая освещенность, изменение температуры окружающей среды)

• несоблюдение положенного для реакции агглютинации времени

• применение загрязненных кровью планшетов, пипеток, предметных стекол;

• неправильная запись исследуемой крови;

Применение неполноценных стандартных сывороток и

стандартных эритроцитов:

• слабые стандартные сыворотки с титром ниже 1:32 или истекшим сроком годности могут вызывать позднюю и слабую агглютинацию;

• применение негодных стандартных сывороток или эритроцитов, нестерильно приготовленных и недостаточно законсервированных, ведет к возникновению неспецифической, «бактериальной» агглютинации.

Особенности испытуемой крови

• наличие в крови слабого агглютиногена А_2,.

• кровь обладает свойством «панагглютинации» или «аутоагглютинации», т. е. дает неспецифическую агглютинацию со всеми сыворотками и даже со своей собственной сывороткой. Для устранения панагглютинации планшет помещают в термостат при температуре 37° на 5 минут, после чего панагглютинация исчезает, а истинная остается.

ТАКТИКА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГРУППЫ КРОВИ

Непосредственно в отделении группа крови определяется врачом по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам или с помощью цоликлонов, после этого в серологической лаборатории производится проверка перекрестным методом. Если результаты совпадают, то группа крови считается определенной. В случае расхождения результатов, производятся повторные исследования.

В экстренных ситуациях можно ограничится реакцией с изогемагглютинирующими сыворотками или цоликлонами, но при возможности следует использовать перекрестный метод.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ФАКТОРА

Для определения резус-фактора применяют несколько методик. При этом используют специальные сыворотки, содержащие антирезус-антитела, которые получают из крови резус-отрицательных людей, иммунизированных резус-фактором. Сыворотка антирезус должна принадлежать к той же группе крови по системе АВО, какая имеется у больного.

Метод агглютинации в солевой среде.

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2 % взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод определения резус-фактора в пробирках с применением желатина. Реакцию проводят в центрифужных пробирках, в которые помещают равные объемы эритроцитов, сыворотки антирезус и 10 % раствора желатина. После встряхивания пробирки помещают в водяную баню при температуре +46-48˚С на 5 минут, после чего добавляют 5-8 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат реакции по наличию агглютинатов, видимых невооруженным глазом.

Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Наиболее чувствительная реакция для выявления неполных антител к ауто - и изоантигенам эритроцитов. Её применяют при возникновении трудностей в определении резус принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на применении антиглобулиновой сыворотки (АГС).

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37˚С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь – резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА с образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстро наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная – агглютинация отсутствует.

Экспресс-методы определения резус-фактора. Эти методы удобны для практических врачей в экстренных случаях.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая не свернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента. Представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), содержащую 33 % раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса “антиген-антитело” и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Экспресс-метод определения Rh-фатора на плоскости без подогрева.

На белой пластинке со смачиваемой поверхностью пишут фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. На левом краю пластинки делают надпись “сыворотка-антирезус”, на правом - “контрольная сыворотка”. Последней служит разведенная альбумином сыворотка группы АВ(IV), не содержащая антител анти-резус. Соответственно надписям на пластинке помещают по 1-2 капли (0,05-0,1 мл) реактива анти-резус и контрольной сыворотки. К обеим каплям добавляют исследуемые эритроциты. Кровь размешивают с реактивом сухой стеклянной палочкой, размазывая на пластинке до образования капли диаметром 1,5 см. пластинку слега покачивают. Через 3-4 минуты для снятия возможной неспецифической агглютинации к каждой капле добавляют 5-6 капель физиологического раствора. Затем пластинку покачивают в течение 5 минут.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации невооруженным глазом.

Наличие хорошо выраженной агглютинации в капле слева указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови, отсутствие агглютинации в этой капле (гомогенная окраска) говорит о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови (Rh-). Результат считается истинным лишь при отсутствии признаков агглютинации в правой (контрольной) капле.