1.2.2. Роль апоптоза в иммунных процессах

Можно выделить 3 стадии развития лимфоцитов, в которых роль апоптоза велика и реализуется по-разному (табл. 1.4):

• стадия до формирования антигенраспознающего рецеп­тора;

  Таблица 1.4. Роль апоптоза на различных этапах развития Т-лим-фоцитов

  Этапы развития	Экспрессия генов факторов, связанных с апоптозом	Проявления апоптоза
  Развитие пред­шественников Т-лимфоцитов (до экспрессии TCR)Селекция кло­нов и диффе-ренцировка суб­популяций	В костном мозге отсутствует экс­прессия bcl-2, в ви-лочковой железе на стадии CD25+ — сильная экспрессия bcl-2, слабая — fasНа стадии CD4+, CD8+ слабая экс­прессия bcl-2, сильная — fas, позже — наоборот	До стадии CD25+ апоптоз раз­вивается в отсутствие ИЛ-7 и фактора стволовых клеток, в процессе перестройки генов рецептора — при непродук­тивной перестройкеCD4+CD8+-THMOUHTbi выжи­вают при условии распознава­ния аутологичных молекул ГКГ на мембране эпителиаль­ных клеток (положительная селекция), наконец, тимоциты гибнут при распознавании ау­тологичных комплексов пеп­тид-молекула ГКГ на поверх­ности дендритных клеток (от­рицательная селекция)

• период формирования рецептора, последующей селек­ции и созревания лимфоцитов;

• период функционирования зрелых лимфоцитов [Яри-лин А.А., 1996].

В первой из этих стадий лимфоциты фактически еще не выделяются из общего семейства кроветворных клеток-пред­шественников. Ранее мы уже говорили о том, что все эти клет­ки нуждаются в факторах выживания, предохраняющих их от самопроизвольного развития апоптоза. Это свидетельствует о предсуществовании в этих клетках программы гибели и отсут­ствии внутренней защиты в виде продукции факторов Bcl-2 и Bcl-x_L. Основным экзогенным фактором выживания пред­шественников лимфоцитов обоих классов служит ИЛ-7. На стадиях, непосредственно предшествующих началу перестрой­ки генов антигенраспознающих рецепторов — CD19⁺CD76⁺ проВ-клеток и CD44⁺CD25⁺ проТ-клеток, синтезируется Bcl-2, и клетки приобретают устойчивость к индукторам апо­птоза, что означает их выход из пула малодифференцирован-ных клеток-предшественников.

Продолжение табл. 1.4

Этапы развития	Экспрессия генов факторов, связанных с апоптозом	Проявления апоптоза
Функциониро­вание зрелых Т-клеток	На покоящихся клетках — сильная экспрессия bcl-2, но не fas. Активи­рованные Т-клетки несут Fas и со вре­менем теряют Bcl-2	Покоящиеся клетки устойчи­вы к индукции апоптоза. Ак­тивированные клетки гибнут при дефиците сигнала, по­вторной стимуляции, связыва­нии CD4, в поздние сроки — спонтанно. Цитотоксические клетки индуцируют апоптоз клеток-мишеней

Далее следует стадия «драматических» перестроек генов В-клеточного и Т-клеточного рецепторов (BCR и TCR соот­ветственно), важной составляющей которых являются разры­вы и рекомбинации нитей ДНК. Это само по себе может слу­жить сигналом к развитию апоптоза (с участием фактора р53). Однако высокий уровень экспрессии Bcl-2 и Bcl-x_L препятст­вует этому. Лишь в случае неудачной реализации перестройки рецепторных генов клетка подвергается апоптозу. После за­вершения перестроек и экспрессии генов рецепторов (BCR на В-лимфоцитах и TCR на Т-лимфоцитах) происходит резкое снижение экспрессии Bcl-2 и Bcl-x_L. Это событие означает на­чало процесса селекции клонов — выбраковки ненужных и опасных для организма клонов лимфоцитов.

Процесс селекции достаточно полно изучен для Т-клеток. Объектом селекции являются кортикальные тимоциты, содер­жащие на поверхности мало рецепторных комплексов TCR-

CD3 и несущие одновременно корецепторы CD4 и CD8. Эти клетки практически лишены Bcl-2 и Bcl-x_L, но содержат на своей поверхности Fas-рецептор. Такое соотношение факто­ров, препятствующих и способствующих развитию апоптоза, обрекает их на гибель в отсутствие специальных факторов за­щиты. Источником защитных сигналов для них служит взаи­модействие их рецептора (TCR) с молекулами главного ком­плекса гистосовместимости (ГКГ) эпителиальных клеткок микроокружения в глубоких слоях коры вилочковой желе­зы, — распознавание аутологичных молекул ГКГ. Если клетка несет рецептор, способный распознавать эти молекулы, она получает «поддерживающий» сигнал, который приводит к уси­лению экспрессии генов рецептора TCR, активации и проли­ферации клетки. Остальные клетки «игнорируются», что озна­чает для них неизбежное развитие апоптоза. Пока не вполне ясно, что служит непосредственным сигналом к развитию апоптоза в данном случае — действие глюкокортикоидов и пу-риновых нуклеотидов, присутствующих в микроокружении, или активные воздействия со стороны окружающих эпители­альных клеток (всех или определенных их субпопуляций).

Положительная селекция сопряжена с диффенцировкой ти­моцитов на субпопуляции клеток CD4⁺CD8~ и CD4"CD8⁺, осно­вой которой является выбор способа распознавания антигенных пептидов в составе молекулы I класса (в их распознавании уча­ствует молекула CD8) или молекулы II класса (распознаваемой с участием CD4). При этом синтез корецептора CD4 в сочетании с TCR, распознающим комплекс пептида с молекулой ГКГ I класса (не комплементарных корецептору), приводит к апо­птозу клетки, так же как экспрессия гена CD8 в сочетании с TCR, распознающим пептид в составе молекул ГКГ II класса. Причиной развития апоптоза в этом случае может служить «неполнота» сигнала от распознавания молекул ГКГ, который оказывается недостаточным для включения защиты от апоптоза.

После положительной селекции тимоциты подвергаются второму туру отбора — отрицательной селекции (пока неясно, как соотносятся во времени этот этап селекции и деление на субпопуляции). На этой стадии выбраковываются аутореак-тивные клетки, т.е. тимоциты, чьи рецепторы распознают ау-тологичные пептиды в составе аутологичных молекул ГКГ. «Проба» на распознавание осуществляется при контакте тимо­цитов, прошедших положительную селекцию и содержащих на своей поверхности больше молекул TCR-CD3, чем в предыду­щий период развития, с дендритными клетками, богатыми мембранными молекулами ГКГ обоих классов. Пространст­венно этот процесс приурочен к кортико-медуллярной и, воз­можно, мозговой зонам вилочковой железы. В случае распо­знавания аутологичного комплекса возникает летальный сиг­нал, приводящий к развитию апоптоза, т.е. к удалению потен­

циально аутореактивных клонов Т-клеток. До сих пор нет чет­кого ответа на вопрос, почему распознавание аутологичных молекул на поверхности эпителиальных клеток защищает ти­моциты от апоптоза, а их распознавание на мембране денд­ритных клеток индуцирует апоптоз тимоцитов. Предполагает­ся, что исход зависит от интенсивности воздействия, опреде­ляемой степенью сродства рецептора по отношению к распо­знаваемому комплексу и плотности молекул TCR и ГКГ на поверхности клеток.

Поскольку не все антигены представлены в вилочковой железе, процесс выбраковки аутореактивных клонов и фор­мирования аутотолерантности продолжается после эмиграции Т-клеток из вилочковой железы. Однако в этом случае значи­тельная часть аутоспецифических клеток не погибает, а бло­кируется вследствие индукции анергии и подавления их ак­тивности супрессорными клетками.

Процесс селекции развивающихся В-лимфоцитов изучен слабее. Однако известно, что и они подвергаются двум этапам селекции. При этом положительную селекцию определяет рас­познавание неизвестного фактора(ов) микроокружения, тогда как отрицательная селекция происходит аналогично тому, как она осуществляется в популяции Т-клеток.

Реальность процессов отрицательной селекции ярко проде­монстрирована в различных системах с трансфекцией генов, де­терминирующих синтез неких чужеродных для данного вида мо­лекул и одновременно рецептора, специфичного в отношении этой молекулы. Поскольку при этом все лимфоциты несут ре­цептор, специфичный к «аутоантигену», они становятся объек­том отрицательной селекции и полностью элиминируются.

Зрелые Т- и В-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в поко­ящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора и экс-прессируют протоонкогены bcl-2 и bcl-x_L, что определяет их ус­тойчивость к индукторам апоптоза. Положение меняется на об­ратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном. Моноклональные антитела анти-Fas не действу­ют на покоящиеся лимфоциты и убивают активированные Т- и В-клетки. Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при самых различных воздействиях — повторной сти­муляции через перекрестное сшивание рецептора, при недостат­ке факторов роста (для Т-клеток — ИЛ-2, для В-клеток — глав­ным образом ИЛ-4), при действии глюкокортикоидов и т.д. Апоптоз может развиться и в процессе активации, например после предварительного связывания молекул CD4 при отсутст­вии костимуляции Т-клеток через CD28, а В-клеток — через CD40 при отсутствии ростовых факторов.

Дифференцировка В-лимфоцитов в клетки, секретирую-щие IgG-антитела, происходящая в зародышевых центрах, со­провождается интенсивным мутагенезом (он происходит в ос­

новном в темных зонах зародышевых центров лимфоидных органов на стадии центробластов). Конечное назначение му­тагенеза в данном случае — появление клонов клеток с более высоким сродством к антигену, чем у исходных В-лимфоци­тов, однако при этом не все мутации приводят к повышению сродства рецептора к антигену, большинство из них даже сни­жают это сродство. Требуются отбор клонов с высоким срод­ством рецепторов к антигену и элиминация прочих клонов. Это происходит в базальных участках светлых зон зародыше­вых центров при взаимодействии В-лимфоцитов (центроци-тов) и фолликулярных дендритных клеток, несущих антиген, на фоне ослабления синтеза Bcl-2 в В-клетках. При сильном сродстве рецептора В-центроцитов к антигену их взаимодей­ствие стабилизируется с помощью связывания молекулы CD40 В-клеток с ее лигандом CD 154 (CD40L), которое служит ис­точником сигнала выживания В-клеток. Лимфоциты, не полу­чившие этого сигнала, гибнут. После завершения этапа селек­ции центроциты перемещаются в апикальные участки светлых зон, а затем мигрируют в мантию зародышевых центров, где дифференцируются в плазматические клетки—продуценты антител и В-клетки памяти. Уже в апикальном отделе светлых зон в В-клетках проявляется экспрессия bcl-2, она возрастает в мантийной зоне. На этих этапах клетки В-ряда становятся ус­тойчивыми к индукторам апоптоза.

После дифференцировки Т-лимфоцитов в эффекторные клетки — цитотоксические Т-лимфоциты, Т-клетки — проду­центы цитокинов, а также в Т-клетки памяти в них также синте­зируется Bcl-2, и они временно приобретают устойчивость к ин­дукторам апоптоза. Однако эффекторные клетки, несущие мар­кер CD45R0, все-таки легче направить на путь апоптоза, чем «наивные» Т-лимфоциты, несущие маркер CD45RA. Кроме того, образование Bcl-2 в эффекторных клетках иммунной сис­темы как Т-, так и В-типа продолжается недолго; его прекраще­ние неизбежно приводит к гибели клеток. В клетках памяти экс­прессия «защитных» протоонкогенов типа bcl-2 продолжается дольше, что обусловливает длительный срок их жизни. Особен­но стабильной оказывается продукция Bcl-2 у клеток памяти с долгим сроком жизни, если они периодически испытывают воз­действие специфического антигена, локализующегося на по­верхности дендритных клеток зародышевых центров.

Известно еще по меньшей мере два аспекта функционирова­ния лимфоцитов, непосредственно связанных с проявлениями апоптоза. Один из этих аспектов — реализация цитотоксической активности лимфоцитов. Клетки-мишени естественных килле­ров и цитотоксических Т-лимфоцитов гибнут при морфологи­ческих и биохимических проявлениях апоптоза, хотя при этом примешиваются некоторые черты некротической гибели клеток. Эта двойственная природа гибели с преобладанием апоптоза

может быть проанализирована на примере наиболее универсаль­ного механизма действия киллеров. Этот механизм состоит из формирования в мембране клетки-мишени пор (вследствие полимеризации перфорина) и поступления через эти поры сери-новых протеаз — гранзимов (главным образом гранзима В), ко­торые включают механизм апоптоза. Среди других механизмов цитотоксического действия Т-лимфоцитов (но не естественных киллеров) могут быть названы Fas-опосредованный апоптоз (в клетках-мишенях увеличивается присутствие Fas-рецепторов, а цитотоксические Т-лимфоциты «нарабатывают» Fas-лиганд) и апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухоли или лимфо-токсином через рецептор 1-го типа (TCRF1).

Другая область функционирования иммунной системы, для которой оказалась важной реализация апоптоза, — защита «иммунологически привилегированных» зон в организме от эффекторных клеток иммунной системы. Недавно выясни­лось, что по крайней мере две такие зоны — внутренние среды глаза и семенники — выстланы клетками, синтезирующими Fas-лиганд. В глазу это клетки эпителия, эндотелия, радужки, сетчатки, ресничных телец, в семенниках — эпителиальные, эндотелиальные и клетки Сертоли (сустентоциты). В результа­те эффекторные Т-лимфоциты, продуцирующие Fas-рецептор, неизбежно гибнут в процессе миграции через этот «барьер» вследствие взаимодействия указанного рецептора с Fas-лиган-дом барьерных клеток, приводящего к апоптозу этих агрессив­ных Т-лимфоцитов [Griffith T.S., 1997].

Таким образом, апоптоз является одним из ключевых про­цессов, определяющих формирование антигенспецифичес-кой составляющей иммунной системы и в значительной сте­пени — реализацию ее эффекторных функций.

Особенно важной оказывается роль апоптоза в обеспечении «неотвечаемости» лимфоцитов, т.е. отсутствия воздействия лим­фоцитов на собственные компоненты организма, что достигает­ся, с одной стороны, формированием аутотолерантности вслед­ствие апоптоза аутореактивных клонов лимфоцитов, а с другой стороны — исключением некоторых областей организма из-под контроля иммунной системы с помощью «барьера», преодоле­вая который, активированные клетки подвергаются апоптозу.