[Sazanov_A.A.]_Genetika(BookFi.org)

6.5. Секвенирование ДНК

Секвенирование нуклеиновых кислот — определение их первичной нуклеотидной последовательности.

Внастоящее время для секвенирования широко используется дидезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», разработанный Ф. Сэнгером в 1977 г. До начала секвенирования производят ПЦР-амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, с использованием в качестве предшественников молекулы дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ). При дидезоксисеквенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотидапраймера длиной 17–25 п.н., поставляющего 3'- гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице, со специфическим участком одной из цепей секвенируемого фрагмента. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида – дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ (один из них — меченый радиоактивным изотопом) – и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ддАТФ, ддТТФ, ддГТФ или ддЦТФ). Затем проводят один цикл амплификации. Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок образуется уникальный набор полинуклеотидов разной длины. В четырех пробирках можно найти последовательности ДНК, различающиеся на 1 нуклеотид. Далее в пробирки добавляют формамид для денатурации фрагментов ДНК и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. После разделения фрагментов ДНК проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК (рис. 71).

Внастоящее время дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля

132

возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез (рис. 72).

Рис. 72. Элекрофореграмма результатов секвенирования фрагмента ДНК. Буквами обозначены соответствующие нуклеотиды: A – аденин, C – цитозин, T – тимин, G – гуанин, символ S обозначает вариант

мононуклеотидного полиморфного сайта (SNP) цитозин – гуанин

Рис. 72. Генетический анализатор AB 3130 (Applied Biosystems). Прибор используют для секвенирования и генотипирования по молекулярным маркерам

133

6.6. Сборка сиквенсов геномов

Метод дробовика (шотгансеквенирование/клонирование) может быть применен для сборки сиквенсов протяженных фрагментов ДНК, в том числе хромосом и геномов. В этом случае ДНК случайным образом фрагментируют. Полученные мелкие сегменты секвенируют обычными методами, например методом Сэнгера. Полученные последовательности перекрывающихся случайных фрагментов ДНК собирают с помощью специальных программ в одну большую последовательность. Существенную трудность при сборке представляют повторяющиеся последовательности ДНК, так как они имеют участки перекрывания с большим числом фрагментов. Для геномов прокариот и низших эукариот метод дробовика оказался подходящим. Геном человека содержит огромное количество (больше половины) разного типа повторяющихся последовательностей. Поэтому для получения совершенной сборки необходимо применение протяженных геномных клонов.

Сборка при помощи протяженных геномных клонов проводится в несколько этапов. Вначале необходимо создать несколько геномных библиотек с покрытием 5–10 эквивалентов генома (разд. 6.4). Затем клоны организуют в контиги (рис. 73). Контиг – это совокупность взаимно перекрывающихся геномных клонов. Для сборки контигов обычно используют геномный фингерпринтинг. Этот метод подразумевает разрезание ДНК-клонов специальными ферментами – рестриктазами и блот-гибридизацию по Саузерну с использованием в качестве зондов минисателлитных последовательностей (небольших повторов с повторяющейся единицей 7 и более нуклеотидов, имеющих более 1000 сайтов локализации в геноме человека). В результате получается индивидуальный набор гибридизующихся с зондом фрагментов для каждого клона. При этом совпадение длин нескольких фрагментов двух клонов говорит о наличии участка перекрывания. Попарное определение участков перекрывания позволяет получить контиг, соответствующий достаточно

134

протяженному участку хромосомы. Затем методом FISH (раз- д. 4.5) определяют локализацию контигов на хромосоме. Протяженные геномные клоны фрагментируют с использованием рестриктаз. Полученные последовательности длиной 500– 700 п.н. встравают в плазмидные векторы. Эта процедура называется субклонированием. Затем субклонированные последовательности секвенируют и при помощи компьютерных программ собирают сиквенс всего геномного клона. Объдинив сиквенсы геномных клонов, получают сиквенсы контигов, а объединив последние – сиквенсы хромосом (рис. 74). Следует отметить, что некоторые районы хромосом, состоящие почти исключительно из повторов (например, центромерные районы), технически не поддаются клонированию и секвенированию и образуют пробелы (гэпы) на картах геномов.

Рис. 73. Образец контига геномных клонов

Рис. 74. Фрагмент геномной последовательности

135

6.7. Биоинформатика и системная биология

Биоинформатика или вычислительная биология — один из разделов биологии, предметом которого являются молекулярные процессы, но в данном случае исследования проводятся не in vitro, а in silico, т. е. не в пробирке, а при по-

мощи компьютеров.

Под биоинформатикой понимают любое использование компьютеров и программного обеспечения для анализа био-

логических данных. На практике часто это понятие сужается и включает в себя только использование компьютеров для об-

работки экспериментальных данных по структуре биологиче-

ских макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) с целью получения биологически значимой информации.

В биоинформатике используются методы прикладной математики, статистики и информатики. Исследования в об-

ластях биоинформатики и системной биологии зачастую пе-

ресекаются. Основные усилия исследователей, работающих в области биоинформатики, направлены на изучение геномов,

анализ и предсказание структуры белков, предсказание взаи-

модействий различных белков друг с другом и другими моле-

кулами, а также реконструкция процессов эволюции.

Биоинформатика помогает ученым, используя последо-

вательности ДНК, прогнозировать структуры и возможные функции кодируемых ими белковых молекул, и таким обра-

зом, связывает геномные и протеомные проекты.

Велика роль биоинформатики в процессе маркирования генов и других объектов в последовательности ДНК.

Эволюционная биология исследует происхождение ви-

дов и их развитие с течением времени. Методы биоинформа-

136

тики активно используются биологами-эволюционистами для решения целого ряда задач:

изучение эволюции большого числа организмов,

включая эволюцию молекул ДНК, а не только строения или физиологии;

сравнение целых геномов, что позволяет изучать такие явления, как дупликация и горизонтальный перенос генов;

построение компьютерных моделей популяций с це-

лью предсказания поведения систем во времени.

Системная биология включает в себя целый ряд сущест-

вующих и перспективных направлений в биологии. Систем-

ную биологию можно определить как междисциплинарную науку о жизни, изучающую сложные взаимодействия в жи-

вых системах и использующую новый подход в биологии: хо-

лизм вместо редукционизма. Задачами системной биологии являются исследование и моделирование свойств сложных биологических систем, которые нельзя объяснить суммой со-

ставляющих ее свойств.

Для верификации создаваемых моделей системная био-

логия работает с самыми различными типами эксперимен-

тальных данных, описывающих как отдельные составляющие,

так и систему в целом. В системной биологии часто исполь-

зуются данные, полученные в других областях биологии: био-

химии, биофизике, молекулярной биологии.

Биологические системы являются очень сложными объ-

ектами. Для их описания используется огромное количество параметров, переменных и уравнений, а значит, развитие со-

временной системной биологии невозможно без использова-

ния компьютерных технологий.

137

Контрольные вопросы и задания

Заполните пропуски в следующих утверждениях:

1.С целью размножения (амплифицирования) и получения в чистом виде тех или иных генов, фрагменты эукариотической ДНК могут быть встроены в специально подготовленные бактериальные вирусы или плазмиды, назы-

ваемые __________.

2.Отдельная колония бактерий, которая содержит плазмиду с включенным в нее фрагментом ДНК человека или другого живого организма, называется _________; набор таких бактерий, представляющий весь геном человека или другого живого организма, составит ____________.

3.Считается, что мутации, не наследуемые согласно правилам Менделя, проявляют ______________ и локализованы, по-видимому, в генах органелл.

4.В генах высших эукариот короткие сегменты кодирующей ДНК, которые называются ___________, обычно разделены длинными последовательностями некодирующей ДНК, которые называются _____________.

138

Глава 7. Геномика

7.1. Понятиягеномики, транскриптомикиипротеомики

Геномика — направление молекулярной генетики, изучающее структурно-функциональную организацию генов и геномов живых организмов.

Геномика сформировалась как особое направление в период создания первых проектов по секвенированию геномов некоторых видов живых организмов в 1980–1990-х гг. Первым был полностью секвенирован геном бактериофага Φ-X174 (5 368 п.н.). Это событие произошло в 1977 г. В 1995 г. был секвенирован геном бактерии Haemophilus influenzae (1,8 млн п.н.). После этого были получены полные сиквенсы геномов еще нескольких видов, включая геном человека (2001 г. — первый черновой вариант, 2003 г.— первый завершенный релиз). Последний по времени релиз – 37.1 – опубликован в августе 2009 г. В нем аннотировано 34533 гена. Хотелось бы отметить, что развитие геномики стало возможно не только благодаря совершенствованию биологических и физико-химических методов, но и появлению более мощной вычислительной техники, которая позволила работать с огромными массивами данных и более совершенного программного обеспечения. Протяженность геномов у живых организмов очень часто измеряется миллиардами пар оснований (геном человека состоит из 3 млрд п. н.), что предполагает необходимость применения существенных компьютерной мощностей для адекватной обработки содержащейся в них информации.

Структурная геномика – раздел геномики, изучающий структуру генов и геномов. Особое внимание уделяется внутреннему строению гена, составу и расположению регуляторных последовательностей, особенностям молекулярной организации хромосом и хромосомных районов, общим принципам структурирования последовательностей геномов.

Функциональная геномика изучает механизмы работы генов и других функционально активных элементов генома. Процессы экспрессии генов и ее регуляции при помощи

139