Очистка днк
В этих методах очистки так или иначе используют два основных различия между нуклеоидной ДНК бактерий и плазмидной ДНК:
1) хромосомы бактерий по размеру много больше ДНК плазмид, обычно используемых в качестве векторов;
2) основная масса ДНК бактерий выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул.
Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК бактерий, случайно захваченные обломки лизированных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании
или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК бактерий остается денатурированной.
Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК бактерий также и при равновесном центрифугировании в градиенте хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистыйэтидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и поэтому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью. Эту методику используют, если необходима высокая степень очистки плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работы с рекомбинантной ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку больших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы препарат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирующими эндонуклеазами, лигирование, трансформацию и даже секвенирование ДНК можно проводить теперь, используя относительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, полученные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее препараты (например, в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5`-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).
Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бактерий. Вообще говоря, чем меньше плазмида, тем лучше достигаемые результаты. С увеличением молекулярной массы плазмиды ее свойства становятся все ближе к свойствам ДНК хозяина. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все плазмиды, обычно используемые при клонировании, относительно невелики и приведенные ниже методы дают хорошие результаты.
Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК щелочным методом из клеток бактерий
1. Наращиваем культуру в 150 мл среды LB+Amp при 37оС (20-24 часа).
2. Осаждаем клетки (4000 об/мин, 15 мин).
3. Ресуспендируем клетки в 2.4 мл раствора I, содержащего 2 мг/мл лизоцима (лизоцим не работает, если рН <8.0).
4. Выдерживаем 15 мин во льду.
5. Добавляем 4.8 мл свежеприготовленного раствора II. Пробирку закрываем
парафилмом и переворачиваем несколько раз осторожно!
6. Выдерживаем 5-10 мин в ледяной бане.
7. Добавляем 7.2 мл охлажденного раствора III. Резко переворачиваем пробирку, заклеенную парафилмом.
8. Выдерживаем 30-60 мин в ледяной бане.
9. Центрифугируем 20 мин при 6000 об/мин при 4оС.
10. К супернатанту добавляем 2V этанола и выдерживаем 1 час в морозильнике (-20оС).
11. Центрифугируем 30 мин при 6000 об/мин при 4оС.
12. Осадок растворяем в 1 мл ТЕ-буфера.
Выделение плазмидной ДНК модифицированным методом щелочного лизиса по Бирнбойму и Долли
Для выделения ДНК культуру клеток выращивают в 3 мл в течение 16 часов при 37оС при интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием на настольной центрифуге, промывают раствором "А"(50 мM Трис-HCl pH 8.0; 25 мM ЭДТА; 10%сахароза) и инкубируют в 100 мкл того же раствора в присутствии 100 мкг/мл лизоцима. Денатурацию проводят добавлением 200 мкл раствора "B", состоящего из 200 мM NаОН и 1%-ого додецилсульфата натрия в течение 1-2 мин. Pенатурацию проводят на ледяной бане в течение 15 мин добавлением 150 мкл раствора "С" (3 М ацетат калия, рН 4.8). После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин отбирают супернатант и осаждают из него ДНК с помощью ПЭГ-8000 (Sigma) в конечной концентрации 6.5%. Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в 100мкл воды. Очистку от примесей РНК осуществляют с помощью инкубации в течение 20 мин при 65оС в растворе LiCl и ацетата аммония в конечных концентрациях 3 М и 2.8 М соответственно. После центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об/мин ДНК из супернатанта осаждают равным объемом изопропанола, промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в воде.