Некоторые сведения о работе с векторными ДНК.
Плазмиды
Генетическая система бактерий состоит из нуклеоида и вненуклеоидных структур. Аналог клеточного ядра у прокариотов (нуклеоид) значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Нуклеоиды бактерий были выделены, их состав и структура изучены довольно подробно, они на 80% состоят из ДНК, кроме которой обнаруживаются различные белки (около 20%) и РНК. Они представляют собой молекулярные комплексы, лишенные оболочки и включающие в себя большую часть ДНК бактерий. ДНК нуклеоида состоит из двунитевых молекул ДНК кольцевой формы. Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом конце линейной молекулы ДНК расположены 5' -конец одной цепи и 3' -конец другой цепи. Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген, т.е., дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют от 3 х 10 8 до 2,5 х 10 9 Д. Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением.
Генетическая информация в бактериях может содержаться во вненуклеоидных (внехромосомных) молекулах ДНК, представленных плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в метаболизме бактериальной клетки. Размеры плазмид необычайно широко варьируют-от 2 тыс. до неск. сотен тысяч пароснований; нек-рые из них содержат 1-3гена, другие достигают 10-20% размера бактериальнойхромосомы.
Это двунитевые молекулы ДНК размером до 10 8 Д, несущие до 50 генов. Количество плазмид в бактериальной клетке может быть от 1 до 200 и несколько более.
Выделяют плазмиды, находящиеся в виде отдельной замкнутой молекулы ДНК и встроенные в хромосому бактерии (интегрированные плазмиды).
Некоторые плазмиды, называемые эписомами, обладают способностью существовать в двух состояниях - автономном и интегрированном. В автономном состоянииэписомане является частью бактериальнойхромосомыи реплицируется (самовоспроизводится) независимо, хотя и синхронно с ней. В интегрирированном состоянии она реплицируется в составехромосомы. Способность обратимо включаться в составхромосомычасто сопряжена с наличием вэписомахмигрирующих генетических элементов.
Плазмиды выполняют регуляторные и кодирующие функции. Первые направлены на компенсацию метаболических дефектов, вторые вносят в бактерию информацию о новых признаках. Как составляющая часть генетического материала бактерии плазмиды играют важную роль в ее жизнедеятельности, детерминируя такие характеристики, как способность продуцировать экзотоксины, ферменты или бактериоцины, устойчивость к лекарственным препаратам и т.д. Удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т.е. увеличивает их «плодовитость». Такие плазмиды обозначают как F -плазмиды или F -факторы (от англ. fertility - плодовитость). Интегрированные F -плазмиды называют Hfr -плазмиды или Hfr -факторы (от англ. high frequency of recombinations - высокая частота рекомбинаций). Hfr -факторы осуществляют перенос части генетической информации данной хромосомы в другую клетку.
Плазмиды, определяющие устойчивость к лекарственным препаратам, называются R -плазмидами или R -факторами (от англ. resistance - устойчивость). R -плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, которые разрушают антибактериальные препараты. В результате бактериальная клетка становится устойчивой к действию целой группы лекарственных веществ. Многие R -плазмиды являются трансмиссивными и, распространяясь в популяции бактерий, переносят резистентность к воздействию антибактериальных препаратов. Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, детерминируя синтез факторов патогенности. Так, например, Ent -плазмида определяет синтез энтеротоксина. Развитие инфекционного процесса, вызванного возбудителями чумы, сибирской язвы, кишечного иерсиниоза, клещевого иксодового боррелиоза связано с функционированием плазмид патогенности.
Обусловленная плазмидами устойчивость бактерий к антибиотикам основана на разных механизмах, но чаще всего-на инактивации последних ферментами (например, b-лактамазой), кодируемых плазмидами, или на избирательном изменении проницаемости клеточной оболочки.
Среди плазмид, обеспечивающих устойчивость бактерий к антибиотикам, основную массу составляют так называемые факторы множественной резистентности, несущие сразу несколько соответствующих детерминант. С помощью трансмиссибельных плазмид детерминанты резистентности легко могут распространяться между видами, способными к конъюгации. На такие плазмиды гены резистентности могут передаваться с помощью транспозонов. Кроме детерминант лекарственной резистентности из числа элементов плазмид хорошо изучены гены некоторых бактериальных токсинов, например энтеротоксинов, вырабатываемых возбудителями кишечных инфекций, носителями так называемых Тох-плазмид (факторов патогенности энтеробактерий). Показана способность Тох-плазмид передаваться между бактериями в организме животных и человека.
На этих плазмидах могут находиться также детерминанты резистентности к антибиотикам. В этой связи активно развивается новое направление в практической бактериологии - поиск и создание веществ, избирательно подавляющих репликацию плазмид или экспрессию их генов. Пример таких веществ - клавулановая кислота и ее производные - ингибиторы b-лактамазы.
Конъюгативные плазмиды переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются F - или R -плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 миллионов Д) и часто выявляются у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копий на клетку и их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы. Неконъюгативные плазмиды обычно имеют небольшие размеры и характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae ,Neisseria gonorrhoeae). Мелкие плазмиды могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве во время клеточного деления. При наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид донор может передавать и неконъюгативные плазмиды за счет связывания генетического материала последних с факторами, обеспечивающими их перенос в процессе конъюгации.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИЙ
Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.
Амплификация в богатой среде
Амплификацию плазмид производят при выращивании бактерии-хозяина в богатой среде в присутствии хлорамфеникола. Ночную культуру (10 мл LB c добавлением антибиотика) пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в 25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют пока культура не достигнет поздней логарифмической фазы (D600=0,6).
Переносят культуру в свежую среду LB с антибиотиком (500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титр удваивается), добавляют антибиотик до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 12-16 ч.
Лизис клеток
Разрушения бактерий для последующего выделения биологически активной ДНК можно добиться разными способами.
- Механические. При этом происходят многочисленные разрывы ДНК.
- У многих бактерий наступает лизис после добавления анионного детергента додецилсульфата (или лаурилсульфата). В частности, так можно разрушить бактерии кишечной группы, пневмококки и гемофильные бактерии.
Додецилсульфат не только разрушает клетки, но и денатурирует некоторые белки. Однако затем он должен быть полностью удален из лизата (что и достигается при последующих обработках), так как его примесь в трансформирующей ДНК мешает самому процессу трансформации.
Некоторые грамположительные бактерии нельзя разрушить только додецилсульфатом или другими поверхностно-активными веществами. Вначале нужно удалить клеточную стенку и затем применить тот или иной детергент. Для разрушения клеточной стенки чаще всего применяют лизоцим. При концентрациях, которые чаще всего применяются для разрушения бактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функции лизоцима сводятся к разрушению клеточной стенки, в результате чего образуются хрупкие протопласты, легко разрушаемые детергентами. При больших концентрациях лизоцим может, видимо, влиять на связь ДНК с цитоплазматической мембраной и даже связываться с ДНК, осаждая ее. Кроме лизоцима, для той же цели употребляют проназу. Проназа способствует более полному гидролизу белка и поэтому лучшей последующей депротеинизации ДНК.
При разрушении бактерий в лизате в числе прочих ферментов появляются дезоксирибонуклеазы. Они, если действие их чем-либо не блокировано, могут тут же разрушить ДНК. Обычно от них защищаются, добавляя вещества, которые связывают ионы магния, требующиеся для работы большинства ДНКаз.
Вещества, связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат), которые добавляют при лизисе клеток для инактивации дезоксирибонуклеаз и предохранения выделяющейся ДНК, подавляют поглощение ДНК компетентными клетками. Додецилсульфат и дезоксихолат также подавляют трансформацию. Лизоцим и проназа, остающиеся в лизате, сами могут лизировать компетентные клетки. В ряде случаев от нежелательных примесей, мешающих трансформации, можно избавиться за счет его разведения.
Для депротеинизации лизата при выделении ДНК используют обработку фенолом, который осаждает додецилсульфат и инактивирует все белки, в том числе и дезоксирибонуклеазы.
Существуют различные методики лизиса. Лизис кипячением и лизис щелочью), отличаются высокой эффективностью и в случае малых плазмид (не более 10 kb) дают выход 2-3 мг/л. Лизис под действием SDS сравнительно более мягкий, и им следует пользоваться в случае больших плазмид ( ≥10 kb).