Гусейнов / Лекция 3.3 Ферменты, праймеры и ДНК

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке

14332, 10679, 6203, 4723

ДНК аденовируса-2

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке

2686

PUC19

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке

4361

PBR322

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

Сайт узнавания

GGTAC↑C C↓CATGG

Источник

Из штамма E.coli несущего клонированный ген KpnI из Klebsiella pneumonia

Субстрат для определения активности

ДНК фага лямбда

Единица активности

За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси.

Оптимальный SE-буфер

B (10 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°C); 10 mM MgCl₂; 1 mM DTT.) + BSA

Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:

Оптимальная температура

37^oC

Условия хранения

10 mM Tris-HCl(pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 200 μg/ml BSA; 1 mM DTT; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Срок хранения фермента 1 год с даты проверки, указанной на фасовке

Лигирование

После гидролиза 20-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены.

Неспецифический гидролиз

Картина cпецифического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 20 ед фермента в течение 16 часов при 37°С.

Чувствительность к метилированию

Не блокируется при перекрывании Dсm-метилированием (C^mCWGG): GGTACCWGG.

Инактивация 20 мин при

80^oC

Примечание

Длительная инкубация с BSA не рекомендуется . Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. С ферментом поставляется 10 Х SE-буфер B, BSA.

Литература:

Smith, D.I., Blattner, F.R., Davies, J. Nucleic Acids Res. 3: 343-353 (1976).  Абдурашитов М. А, Чернухин В. А., Томилов В. Н., Гончар Д. А., Дегтярев С. Х. Рестрикционный анализ ДНК человека – новые возможности в ДНК-диагностике // Медицинская генетика, Т.6, № 8, с 29-36, 2007

Теоретические электрофореграммы разделения фрагментов ДНК в 1%-ном агарозном геле 1хТБЕ для наиболее популярных плазмидных и вирусных ДНК: Длины фрагментов на дорожке

15000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000

Маркер

M - маркер, 1 - ДНК аденовируса-2, 2 - ДНК фага Лямбда, 3 - ДНК фага T7, 4 - pUC19, 5 - pBR322

Название

ДНК фага лямбда

Источник

Выделена из бактериофага Лямбда cI857S7 который был индуцирован температурой из лизогенного штамма E.coli несущего системы метилирования Dam, Dcm

Описание

Двухцепочечная линейная ДНК длиной 48502 пары оснований. Молекулярный вес - 31.5х10⁶ дальтон

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA. Хранить при - 20°С.

Название

ДНК фага T7

Источник

Выделена из бактериофага Т7 который получен из инфицированого штамма E.coli с неактивными системами метилирования Dam, Dcm

Описание

Двухцепочечная линейная ДНК длиной 39936 пар оснований. Молекулярный вес 26х10⁶ дальтон.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl; (pH 7.8); 1 mM EDTA. Хранить при - 20°С.

Название

ДНК pUC19

Источник

Выделена из штамма E.coli XL1-Blue несущего системы метилирования Dam, Dcm

Описание

Плазмида широко используется в качестве вектора для клонирования в E.coli, представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК длиной 2686 пар оснований. pUC19 несет полилинкер длиной 54 пары оснований и состоящий из сайтов 13ти рестриктаз узнающих гексануклеотидные палиндромные последовательности. Молекулярный вес - 1.75х10⁶ дальтон

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA. Хранить при - 20°С.

1.4% TAE агарозный гель 1 дорожка ДНК pUC19 (0.3 мкг) 2 дорожка ДНК pUC19 гидролизованная HindIII (0.3мкг) 3 дорожка 1 Kb ДНК маркер a Кольцевая форма b Линейная форма c Суперскрученная форма

Название

ДНК pBR322

Источник

Выделена из штамма E.coli XL1-Blue несущего системы метилировная Dam, Dcm

Описание

Плазмида широко используется в качестве вектора для клонирования в E.coli, представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК длиной 4361 пар оснований. pBR322 содержит гены устойчивости к ампицилину и тетрациклину. Молекулярный вес - 2.83х10⁶ дальтон.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA. Хранить при - 20°С.

1.4% TAE агарозный гель 1 дорожка ДНК pBR322 (0.3 мкг) 2 дорожка ДНК pBR322 гидролизованная FauNDI(0.3мкг) 3 дорожка 1 Kb ДНК маркер a Кольцевая форма b Линейная форма c Суперскрученная форма

Название

ДНК pHspAI2/GsaI

Источник

pHspAI2 выделена из штамма E.coli (dam+, dcm+) с использованием стандартной методики

Описание

Субстрат pHspAI2/GsaI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI2, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции GsaI.   pHspAI2 (4118 п.о.) является модификацией плазмиды pHspAI1. Помимо фрагмента геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species A1, включающего ген ДНК-метилтрансферазы M.HspAI, pHspAI2 содержит единственный канонический сайт узнавания GlaI. 

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA. Хранить при - 20°С

Название

ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp (11 фрагментов от 50 до 1000 bp)

Описание

Представляет собой смесь специальных плазмид, гидролизованных определенными ферментами с образованием 11 фрагментов, пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA; 50mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера. Мы рекомендуем наносить 0,5-1 мкг ДНК маркера на дорожку.

1 мкг 100bp+50bp ДНК маркера в 1,7 % ТАЕ агарозном геле.

Название

ДНК-маркеры 100 bp (10 фрагментов от 100 до 1000 bp)

Описание

Представляет собой смесь специальных плазмид гидролизованных определенными ферментами с образованием 10 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера. Мы рекомендуем наносить 1 мкг ДНК маркера на дорожку.

1 мкг 100bp ДНК маркера в 1,7 % ТАЕ агарозном геле.

Название

ДНК-маркеры 100 bp + 1.5 Kb (11 фрагментов от 100 до 1500 bp)

Описание

Представляет собой смесь специальных плазмид гидролизованных определенными ферментами с образованием 11 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера. Мы рекомендуем наносить 1 мкг ДНК маркера на дорожку.

1 мкг 100bp+ 1,5Kb ДНК маркера в 1,7% ТАЕ агарозном геле.

Название

ДНК-маркеры 100 bp+1.5 Kb+3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 bp)

Описание

Представляет собой смесь специальных плазмид гидролизованных определенными ферментами с образованием 12 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера. Мы рекомендуем наносить 1 мкг ДНК маркера на дорожку.

1 мкг 100bp+ 1,5Kb+ 3Kb ДНК маркера в 1,7% ТАЕ агарозном геле

Название

ДНК-маркеры 1 Kb (13 фрагментов от 0.25 до 10 Kb)

Описание

Представляет собой смесь специальных плазмид гидролизованных определенными ферментами с образованием 13 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

ДНК маркер не предназначен для определения количества ДНК, однако может быть использован для приблизительной оценки путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера. Мы рекомендуем наносить 0,5-1 мкг ДНК маркера на дорожку.

1 мкг 1Kb ДНК маркера в 1 % ТАЕ агарозном геле

Название

pUC19/Msp I

Описание

Представляет собой плазмиду pUC19 гидролизованную ферментом Msp I с образованием 12 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

Рекомендуется наносить 1 мкг ДНК маркера на 1 дорожку.

1 мкг pUC19/MspI ДНК маркера в 1,7% ТАЕ агарозном геле.

Название

pUC19/Kzo9 I (Sau3AI)

Описание

Представляет собой плазмиду pUC19 гидролизованную ферментом Kzo9 I с образованием 15 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Длины фрагментов

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

Рекомендуется наносить 1 мкг ДНК маркера на 1 дорожку.

1 мкг pUC19/Kzo9I ДНК маркера в 1,7% ТАЕ агарозном геле.

Название

pBR322/BsuR I (HaeIII)

Описание

Представляет собой плазмиду pBR322 гидролизованную ферментом BsuR I с образованием 22 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Длины фрагментов

Условия хранения

10 mM Tris-HCl(pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl. Хранить при - 20°С.

Примечание

Рекомендуется наносить 1 мкг ДНК маркера на 1 дорожку.

Название

pBR322/Alu I

Описание

Представляет собой плазмиду pBR322 гидролизованную ферментом Alu I с образованием 9 фрагментов пригодных для использования в качестве стандарта молекулярных весов в агарозном гель-электрофорезе.

Длины фрагментов

Условия хранения

10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl.. Хранить при - 20°С.

Примечание

Рекомендуется наносить 1 мкг ДНК маркера на 1 дорожку.

1 мкг pBR322/AluI ДНК маркера в 1,7% ТАЕ агарозном геле

Название

pUC19/Msp I