Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-3ver7
.pdf
Глава 7 |
Структура гена |
|
|
генужеврукахэкспериментатора,т.е.полностью ли выделены его регуляторная и структурная части. Для выяснения этого вопроса в состав транспозона вводят фрагмент ДНК, предположительно содержащий ген, это фрагмент “А” в транспозоне P[(ry+)A] на Рис. 7.29. Затем хромосому со встроенным транспозоном P[(ry+)A] путем скрещивания вводят мухам, гомозиготным по мутации испытуемого гена. Если в транспозоне присутствуютвсечастигена“А”,необходимые дляегофункционирования,тотакаяособьбудет иметь нормальный фенотип, поскольку мутантное действие гена А полностью перекрывается нормальным аллелем А+, расположенным в транспозоне. Происходит “спасение” (rescue) мутантного фенотипа - формируетсянормальный.
Нетруднозаметить,что,хотяэтиработыи выполнены на дрозофиле, по сути здесь речь идетовозможностиисправлениягенетических дефектов посредством вмешательства человека. Если учесть, что трансформация у дрозофилы за последние 16 лет применялась тысячи раз, становится очевидным, что по крайней мере на этом модельном объекте проблемаисправлениягенетическихдефектов уже в наше время эффективно решается достаточнорутиннымиметодами.
2.Другая цель использования трансформации заключается в исследовании структуры самого гена, т.е. анализа его структурнойирегуляторнойчастей(см.Раздел 7.7.).
3.Трансформацию на дрозофиле используютдляэкспериментальнойэкспрессии геновиздругихорганизмов,укоторыхещене открытымобильныеэлементы,пригодныедля создания транспозонов, и не разработаны методы трансформации. Например, можно выделить какой-то ген из генома бабочкишелкопряда, комара или человека, ввести в
геном дрозофилы и проанализировать экспрессию.
Созданы еще более уникальные конструкции,связанныеспересадкамигенов. Можнопривестиодинпример.Известно,чтов геноме комара Chironomus thummi thummi
присутствуютфракции,повторенныемножество раз.Единицейэтогоповтораявляетсяфрагмент длиной 120 п.н., обогащенный А-Т нуклеотидами.ЭтотакназываемыйCla-повтор. Он рассеян по всей длине хромосом Ch. th. thummi, но почти полностью отсутствует у оченьблизкоговидаCh.th.piger,т.е.этотповтор является варьирующей фракцией генома. Считается, что повторенные последовательности оказывают инактивирующее влияние на гены, расположенныерядом.
Для того, чтобы проверить предположениеобинактивирующемвлиянии Cla-повтора, был создан транспозон, содержащийкромемаркерногогенаrosy+,еще последовательностьнуклеотидов,состоящую из нескольких копий Cla-повтора из ДНК хирономусаирасположенногорядомснимгена white (w), выделенного из генома дрозофилы. Этот транспозон был введен в эмбрионы дрозофилы, мутантные по гену w. Дело в том, чтонормальныйаллельгенаw+,обеспечивает формированиекрасногоцветаглазумухи,вто времякакугомозиготпомутацииwглазабелого цвета. Если Cla-повтор не оказывает инактивирующего влияния на ген w+ в транспозоне, глаза у мух w/w/Tw+ будут нормального красного цвета. Если же Claповтор инактивирует ген w+ в транспозоне во всехклеткахилитольковнекоторых,тоглазау мухбудутсоответственнополностьюбелыми или мозаичными, т.е. в некоторыхклетках ген w+ сохраняютактивность,вдругихклеткахw+ инактивирован.
4.Поискиэнхансеровгенов.
5.Создание систем трансформации для направленнойэкспрессиигенов.
6.Индукциякроссинговераусамцов.
Литература к разделу 7.4.11.
Жимулев И.Ф. Трансформация у дрозофилы - новый подход в генетике. Соросовский образовательный журнал 2000, в печати.
AshburnerM.Drosophila.Alaboratoryhandbook.Cold SpringHarbor,ColdSpringHarborLaboratory Press, 1017-1063, 1989.
BrandA.H.,PerrimonN.Targetedgeneexpressionasa means of altering cell fates and generating
172
Структура гена Глава 7
dominantphenotypes.Development118:401- |
генов,кодирующихбелкиинекоторыеsnРНК, |
||||||
415, 1993. |
|
|
РНК-полимераза III транскрибирует гены 5S |
||||
GehringW.J.Themastercontrolgeneformorphogenesis |
рРНК,тРНКиостальныеsnРНК. |
|
|||||
and evolution of the eye.Genes to Cells 1: 11- |
Схема организации типичного гена |
||||||
15, 1993. |
|
|
|||||
|
|
представленанаРис.7.30.Каждыйгенсостоит |
|||||
HalderG.,CallaertsP.,GehringW.J.Newperspectives |
|||||||
из регуляторной части, с которой начинается |
|||||||
oneyeevolution.CurrentOpinioninGenetics |
транскрипция кодирующей части, в которой |
||||||
& Development 5: 602-609, 1995. |
|
записана информация о структуре белка, и |
|||||
LawrenceP.A.Themakingofafly.Oxford,Blackwell |
|||||||
ScientificPublications,1-228,1992. |
|
терминирующейчасти,вкоторойзавершается |
|||||
|
транскрипция.ДвойнаяспиральДНКвобласти |
||||||
Prasher D.C. Using GFP to see the light. Trends in |
|||||||
Genetics 11: 320-323, 1995. |
|
промотораденатурируетсяподдействиемРНК- |
|||||
|
|
|
|
|
|||
SpradlingA.C.P-elementmediatedtransformation.In: |
полимеразыупрокариотилитранскрипционного |
||||||
“Drosophila: a practical approach” (D.B. |
комплексауэукариот(Рис.7.31)собразованием |
||||||
Roberts, ed.), Oxford-Washington,IPL Press, |
“транскрипционного |
пузырька”. РНК |
|||||
p. 175-197, 1986. |
|
синтезируется в направлении от 5' к 3' концу |
|||||
Wilson C. Pearson R.K., Bellen H.J., OÒKane C.J. |
одной из цепей ДНК, которая называется |
||||||
Grossniklaus U., Gehring W.J. P-element- |
матричной. Вторая |
öåïü |
называется |
||||
mediatedenhancerdetection:anefficientmethod |
кодирующей. |
|
|
|
|||
forisolatingandcharacterizingdevelopmentally |
Транскрипция заканчивается, когда |
||||||
regulated genes in Drosophila. Genes & |
|||||||
молекула РНК-полимеразы |
достигнет |
||||||
Development 3: 1301-1313, 1989. |
|
терминирующегоучасткаилитерминатора(Рис. |
|||||
|
|
|
|||||
7.5. Структура транскрипта: |
7.30). Обнаружено два типа терминирующих |
||||||
последовательностей,икаждыйгенимеетодин |
|||||||
структурная и регуляторная |
|||||||
из них. Один тип последовательностей |
|||||||
части гена |
|
|
|||||
|
|
опознаетсянепосредственноРНК-полимеразой, |
|||||
СинтезРНК,кодируемойданнымгеном, |
другойтип-РНК-полимеразойвассоциациис |
||||||
называется экспрессией гена. У прокариот |
ρ -фактором. |
|
|
|
|||
единственная РНК полимераза, состоящая из |
Исследованиепроцессов,происходящих |
||||||
белкового комплекса - собственно РНК- |
при синтезе мРНК, показало, что продукты |
||||||
полимеразыиσ -фактора,синтезируетвсевиды |
транскрипции,синтезируемыевядрахэукариот |
||||||
РНК:мРНК,тРНКирРНК. |
|
на ДНК хромосом, гораздо крупнее, чем |
|||||
УэукариоттриразныхРНК-полимеразы |
образуемыеизнихивыходящиевцитоплазму |
||||||
транскрибируютРНКстрехразныхтиповгенов. |
матричные РНК, поступающие в рибосомы и |
||||||
РНК-полимераза I синтезирует 18, 28 и 5.8S |
участвующие |
в трансляции. Такие |
|||||
PHK, ÐÍÊ-полимераза II считывает мРНК с |
транскрибированные с ДНК и находящиеся в |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 7.30 |
|
|
|
|
|
|
|
|
РНК-полимераза |
|
|
РНК-полимераза |
|||
ÄÍÊ |
РНК-полимераза |
Транскрипция |
РНК-полимераза |
||||
|
|
||||||
|
Промотор |
Стартовая точка |
Терминатор |
|
|||
|
|
транскрипции |
|
|
|
||
|
Участок выше Участок ниже |
|
|
|
|||
старта транскрипции старта транскрипции |
|
|
|
||||
(- нуклеотид) (+ нуклеотид)
Единица транскрипции, содержащая различные элементы гена (Из: Lewin, 1994, p. 378).
173
Глава 7 |
Структура гена |
|
|
Рисунок 7.31 |
|
|
|
Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их |
|
Направления движения фермента |
экспрессия. Москва, Наука, 1-254, 1989. |
||||
кодирующая цепь ДНК |
|
|
|
Гершензон С.М. Основы современной генетики. |
|
|
|
|
Киев, Наукова Думка, 349-356, 1983. |
||
|
|
|
|
||
точка ренатураци |
5’ |
3’ |
точка денатурации |
Гвоздев В.А. Регуляция активности генов при |
|
|
|
||||
|
|
|
|
созревании клеточных РНК. Соросовский |
|
|
3’ |
5’ |
|
образовательный журнал 12: 11-18, 1996. |
|
|
|
|
Овчинников Л.П. Что и как закодировано в мРНК. |
||
|
|
3’ |
матричная цепь ДНК |
||
5’ |
|
Соросовский образовательный журнал 4: |
|||
|
РНК-ДНК гибрид |
||||
|
|
10-18, 1998. |
|||
сайт связывания РНК |
|
|
|
||
Транскрипционный “пузырек”. (Из: Lewin, |
LewinB.GenesV.OxfordUniversityPress.Oxford,New |
||||
York, Tokyo, 377-401, 1994. |
|||||
1994, p. 380). В ходе транскрипции РНК- |
|||||
Russell,P.J.GeneticsFifthedition.MenloPark,California, |
|||||
полимераза денатурирует двуцепочечную |
|||||
AddisonWesleyLongmanInñ,379-417,1998. |
|||||
спираль ДНК и вновь восстанавливает ее, |
|||||
|
|||||
поддерживает кодирующую и матричную |
7.6. Регуляторная часть гена |
||||
цепи ДНК в выпрямленном состоянии и |
|||||
|
|||||
синтезирует РНК. |
|
|
|
|
|
|
|
7.6.1. Промоторы и регуляторы |
|
клеточномядрепредшественникимРНК,очень |
|||
разнообразные по своему нуклеотидному |
|
У прокариот процесс транскрипции |
|
|
осуществляется с помощью голоэнзима (или |
||
составу,называютсягетерогеннымиядерными |
|||
РНКилипро-мРНК. |
|
“полногоэнзима”)РНК-полимеразы,состоящей |
|
|
из собственно РНК-полимеразы и |
||
Выяснилось,чтовгетерогенныхядерных |
|||
присоединяющегося к ней σ -фактора. |
|||
РНК присутствуют протяженные участки, |
Собственно РНК-полимераза состоит из 4-х |
||
считанные с участков генов, некодирующих |
|||
полипептидов-двухα ,β ,β ’-субъединиц.РНК- |
|||
информацию о структуре белка - интронов. В |
полимеразаосуществляетосновнуюреакцию |
||
результатесложногопроцессасозреваниеРНК, |
полимеризациирибонуклеотидов,еефункция |
||
называемогопроцессингом,образуетсязрелая |
заключаетсявкопированииоднойнитидвойной |
||
молекула матричной РНК уже существенно |
|
цепи ДНК в РНК, σ -фактор необходим для |
|
меньшего размера. В ходе процессинга (или |
опознаванияпромотора-определенногоучастка |
||
постранскрипционных модификаций РНК) |
|
вначалегена. |
|
удаляютсяучастки,соответствующиеинтронам, |
Промоторы имеют определенные |
||
|
|
||
происходит сращивание экзонов (сплайсинг), |
последовательностинуклеотидов,“узнаваемые” |
||
добавляетсякороткийфрагментна5'конце(5'- |
РНК-полимеразой.Более100промоторовбыли |
||
кэп)иполи(A)+-хвостна3'концемолекулыРНК. |
секвенированы у E. coli, и наиболее |
||
НаРис.7.32представленасхемастроения |
удивительнымбылопочтиполноеотсутствие |
||
зрелойбиологическиактивноймРНКиз |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
Рисунок 7.32 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
клеток эукариот. Аналогичная мРНК |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
Сигналы инициации трансляции по |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
обнаруживаетсяивклеткахпрокариот, |
|
|
|
|
сканирующему механизму |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
íî |
â |
íåé |
íåò |
ïîëè(A)+ |
|
|
|
|
|
|
|
Перекодирующие |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
последовательности. |
|
|
|
|
|
|
|
|
сигналы |
|
|
|
Сигналы |
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Изменение |
|
цитоплазматического |
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Сдвиг |
Прыжок |
смысла |
|
|
и ядерного |
||||||||||||
Литература к разделу 7.5. |
|
|
|
рамки |
рибосомы кодона |
|
полиаденилирования |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
АлиханянС.И.,АкифьевА.П.,ЧернинЛ.С. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Êýï |
5’-ÍÒÎ |
AUG |
|
Транслируемая область |
Ñòîï |
3’-ÍÒÎ |
ïîëè(À) |
|
|||||||||||||||||
|
Общая генетика. Москва, Высшая |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
школа, 1-446, 1985. |
|
5’ нетранслируемая |
Сигнал |
|
Элементы |
|
|
Сигнал |
|
|||||||||||||||
Георгиев Г.П. Гипотеза о структурной |
лидерная |
внутренней |
|
нестабильности |
|
внутриклеточной |
|||||||||||||||||||
последовательность |
инициации |
|
ìÐÍÊ |
|
|
локализации |
|
||||||||||||||||||
|
организации оперона и регуляции |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3’ нетранслируемая |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
трейлерная |
|||||||||||
|
синтеза РНК в животной клетке. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
последовательность |
|||||||||||
|
Молекулярная биология 4: 17-29, |
Схема расположения функциональных участков на |
|||||||||||||||||||||||
|
1970. |
|
|
|
молекуле мРНК (Из: Овчинников, 1998, с. 17). |
|
|
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
174
Структура гена |
|
|
Глава 7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 7.33 |
|
|
|
-35 |
-10 |
|
+1 |
TTGACA 16-19 ï.í. |
TATAAT |
5-9 ï.í. |
Кодирующая часть |
|
домен |
|
старт |
|
Прибнова |
транскрипции |
|
Наиболее типичный промотор прокариот, имеющий три компонента: консенсусы последовательностей в точках -10, -35 и стартовая точка транскрипции (Из: Lewin, 1994, p. 395). Частоты встречаемости последовательности нуклеотидов в положении -10 (указана в %% под названием нуклеотида): T80 A95 t45 A60 a50 T96, частоты встречаемости последовательности в положении -35: T82 T84 G78 A65 C54 a45.
гомологии 60-нуклеотидного района, |
30,апослеперемещенияферментананесколько |
|||||||||
связывающего РНК-полимеразу. Гомологию |
пар нуклеотидов, он становится еще более |
|||||||||
имеют только три очень короткие |
компактным,превращаясьвкомплексэлонгации |
|||||||||
последовательностивположении-10и-35п.н. |
(Ðèñ. 7.34). |
|
|
|
|
|
||||
ивстартовойточкетранскрипции.Расстояние |
У эукариот процесс транскрипции |
|||||||||
между этими доменами также является |
значительно усложн¸н в связи с тремя |
|||||||||
фиксированным. На Рис. 7.33 показаны |
обстоятельствами. Во-первых, у эукариот |
|||||||||
наиболее типичные элементы промотора у |
транскрипцияосуществляетсяподдействием |
|||||||||
прокариот. |
|
|
трехразныхРНК-полимераз. |
|
|
|||||
ВначалеРНК-полимеразаконтактируетс |
Во-вторых,РНК-полимеразаэукариотне |
|||||||||
районом от -55 до +20 п.н. (Рис. 7.34). |
может |
самостоятельно |
инициировать |
|||||||
Инициирующий комплекс содержит РНК- |
транскрипцию. Для ее активирования |
|||||||||
полимеразу и σ -фактор, который слабо |
необходимо |
большое |
число белков, |
|||||||
связываетсясучасткомпромоторавположении |
называемыхобщимифакторамитранскрипции, |
|||||||||
-35п.н.,контролируяпосадкуРНК-полимеразы |
которые должны объединяться в комплекс, |
|||||||||
именнонапромотор. |
|
Дополнение 7.6 |
|
|
|
|
||||
Затем РНК-полимераза связывается с |
|
|
|
|
||||||
Нобелевская премия за 1959 год |
||||||||||
доменомПрибнова–райономвположении-10. |
||||||||||
присуждена С. Очоа (Severo Ochoa) за |
||||||||||
Одновременносэтимрасплетается полностью |
||||||||||
открытие механизма биологического |
||||||||||
почтидвавиткадвойнойспиралиДНК(длиной |
||||||||||
синтеза рибонуклеиновой кислоты. |
||||||||||
в 17 п.н.) вокруг нуклеотида в положении -10. |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
||||
Следует отметить, что в этом Рисунок 7.34 |
|
|
|
|
|
|
||||
положенииприсутствуютвосновном |
Комплекс инициации |
-50 |
-40 |
-30 -20 |
-10 |
1 |
+10 +20 +30 |
|||
АТ нуклеотиды, имеющие по две |
содержит σ -фактор и |
|
|
|
|
|
|
|||
водородныхсвязимеждусобой,что |
связывается с участком |
|
|
|
|
|
|
|||
значительнооблегчаетвозможность |
75-80 ï.í. ÄÍÊ |
|
|
|
|
|
|
|||
ихразъединения. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Поскольку промоторы слегка |
Первоначальный комплекс -50 |
-40 |
-30 -20 |
-10 |
1 |
+10 +20 +30 |
||||
различаются |
ïî |
элонгации |
|
|
|
|
|
|
|
|
утрачиваетσ |
|
|
|
|
|
|
|
|||
последовательностямнуклеотидов, |
-фактор и |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
контакты с ДНК в районе |
|
|
|
|
|
|
||
эффективность связывания РНК- |
îò -35 äî -55 |
|
|
|
|
|
|
|
||
полимеразы, а следовательно, и |
Общий комплекс |
-50 |
-40 |
-30 -20 |
-10 |
1 |
+10 +20 +30 |
|||
скорость транскрипции сильно |
элонгации |
|
|
|
|
|
|
|
||
варьируетотгенакгену. |
связывается с участком |
|
|
|
|
|
|
|||
Когдаσ -фактордиссоциирует, |
|
|
|
|
|
|
||||
ДНК длиной 30-40 п.н. |
|
|
|
|
|
|
||||
собственно |
РНК-полимераза |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
укорачивается в положении выше - Начало транскрипции (Из: Lewin, 1994, p. 385). |
||||||||||
175
Глава 7 |
Структура гена |
|
|
прежде чем транскрипция начнется. Формирование комплекса - это многоступенчатый процесс, от прохождения этапов которого будет в конечном счете зависетьскоростьинициациитранскрипции.Во многихслучаяхрегуляторныебелкидействуют, влияя главным образом на процесс сборки транскрипционногокомплекса.
И, наконец, в-третьих, большинство регуляторныхбелковуэукариотмогутвлиять наскоростьтранскрипциидажееслиэтибелки связываются с участками ДНК, расположеннымизатысячипарнуклеотидовот промотора.
Рассмотрим сначала организацию контролирующейзоныгена,транскрибируемого с помощью РНК-полимеразы II. Контролирующей областью называют последовательностиДНК,необходимыекакдля инициациитранскрипции,такидлярегулирования ее скорости и интенсивности. Поэтому контролирующийрайонсостоитизпромотора, на котором образуется комплекс из РНКполимеразыIIиобщихфакторовтранскрипции, а также многочисленные регуляторные последовательности,скоторымисвязываются различные регуляторные белки (Рис. 7.35). Регуляторные элементы гена могут быть расположеныкаквыше,такинижеточкиначала транскрипции.Однимизнаиболееизвестных регуляторных элементов гена является промотор, который состоит из нескольких элементов. Из них самым близким к точке началатранскрипцииявляетсяTATA-домен(5’- TATAAA-3’),называемыйпо-другомудоменом Хогнесса или доменом Голдберга-Хогнесса. ЗатемследуютдоменыCAAT(5’-GGCCAATCT- 3’) и GC (5’-GGCCGG-3’). Промоторы могут содержатьразличныекомбинациипромоторных
элементов,нониодинэлементневстречается во всех промоторах, например, у D. melanogasterбылипроанализированыданныео первичной структуре 252 независимых промоторов. ТАТА-домен находится в положении-25/-30.Неожиданнобылонайдено, что половина промоторов у дрозофилы не имеют ТАТА-домена (Arkhipova, 1995). Некоторые промоторы имеют более одной копии CAAT или GC. Домен CAAT играет существеннуюрольвинициациитранскрипции, TATA и GC, по-видимому, выполняют вспомогательныероли.
Общие факторы транскрипции к настоящемувремениочищеныивыделены(Рис. 7.36).Ихшесть:TFIIA,TFIIB,TFIID,TFIIE,TFIIF иTFIIH. Ониназываютсяпервымибуквами отсловtranscriptionfactors–TFсдобавлением римскойцифрыI,II,илиIIIвзависимостиоттого, какая это РНК-полимераза, I, II или III. Далее следует нумерация собственно молекулы. Вместе с РНК полимеразой II они могут инициироватьтранскрипциювовнеклеточных системахinvitro.Некоторыеизобщихфакторов транскрипциивсвоюочередьсостоятизмногих полипептидов. Наиболее интересны TFIID, которые в своем составе содержат белки TBP (TATA-boxbindingprotein)иоколо8связанных снимидругихмолекул,т.н.TAF(TBP-associated factors).Сложнуюорганизациюимееткомплекс TFIIH. У млекопитающих РНК-полимераза II состоит из 12-14 полипептидов, в результате чего молекулярная масса этого комплекса доходит до 600 килодальтон (кДа). В состав транскрибирующегокомплексавходятнедавно открытыебелки,называемыеSRB(suppressors ofRNAPolII),которыесвязываютсясбольшой субъединицейРНК-полимеразы(Рис.7.36).Эти белки помогают РНК-полимеразе разрушить
Рисунок 7.35
-120 |
-100 |
-80 |
-60 |
-30 |
|
|
|
-10 |
+1 Транскрипция |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
GC |
GC |
|
|
CAAT |
TATA |
|
|
|||||||
4 |
4 |
|
|
3 |
|
|
2 |
|
|
1 |
||||
Структура промотора у эукариот. 1 - точка начала транскрипции; 2 - последовательность ТАТА, она, вероятно, контролирует выбор стартовой точки транскрипции; 3 - последовательность СААТ, она, по-видимому, контролирует первоначальное связывание РНК-полимеразы с промотором, 4-GC - домен, с его помощью, по-видимому, происходит связывание РНКполимеразы с окрестностями стартовой точки транскрипции.
176
Структура гена |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Глава 7 |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
â |
результате |
÷åãî |
|||
Рисунок 7.36 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+1 |
|
|
формируется“минимальный |
|||||
à |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
комплекс |
инициации |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
транскрипции”.Теперьдля |
||||
|
|
NRE |
|
|
PRE |
|
|
TATA |
|
INR |
|
||||||||
|
|
TFIID (TBP + TAFs) + TFIIA |
|
|
|
|
|
|
|
началатранскрипцииРНК- |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
TAFs |
|
|
|
|
|
полимераза |
II |
должна |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
освободитьсяоткомплекса |
||||||
á |
|
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
факторов транскрипции. |
|||||||
|
|
|
|
|
TBP |
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
NRE |
|
|
PRE |
|
|
TATA |
|
INR |
|
Ключевым в процессе |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
TFIIB |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
инициации транскрипции |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
TAFs |
|
|
|
|
|
является присоединение |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
â |
|
|
|
|
|
A |
|
|
B |
|
|
|
|
факторов транскрипции |
|||||
|
|
|
|
|
TBP |
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
TFIIH è TFIIE. Îäíà èç |
||||||||||
|
|
NRE |
|
|
PRE |
|
|
TATA |
|
INR |
|
||||||||
|
|
TFIIE-TFIIF-RNA Pol II+ TFIIH |
|
|
|
|
|
|
|
субъединиц |
|
TFIIH, |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Pol II |
обладающая |
протеин- |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
TAFs |
|
киназной активностью, |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H |
||||||||
ã |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
фосфорилирует молекулу |
|||||||
|
|
|
|
|
A |
TBP |
B |
|
|
F E |
|||||||||
|
|
NRE |
|
|
PRE |
|
|
TATA |
|
INR |
|
РНК-полимеразы II. В |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Сборка общего транскрипционного комплекса. а. Типичный |
присутствии АТФ TFIIH |
||||||||||||||||||
промотор гена эукариот, содержащий элемент инициации |
фосфорилирует |
ÐÍÊ- |
|||||||||||||||||
транскрипции (INR) и ТАТА-домен, а также некоторое число |
полимеразу |
|
II. |
||||||||||||||||
позитивных (PRE) и негативных регуляторных элементов (NRE). |
Ô î ñ ô î ð è ë è ð î â à í è å |
||||||||||||||||||
б-г. Порядок сборки общих факторов транскрипции и РНК- |
происходитвзонедлинного |
||||||||||||||||||
полимеразы II на промоторе (Из: Hanna-Rose, Hansen, 1996). |
полипептидного“хвоста”,в |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
результате чего молекула |
||||
нуклеосомы и декомпактизовать молекулу |
|
|
|
|
|
||||||||||||||
полимеразы изменяет конформацию, |
|||||||||||||||||||
ÄÍÊ. |
|
|
|
|
|
|
|
|
становится готовой к транскрипции и |
||||||||||
|
Довольно давно было показано, что |
||||||||||||||||||
|
освобождаетсяотвсехфакторовтранскрипции, |
||||||||||||||||||
молекулафакторатранскрипцииTFIIHсвязанас |
кроме TFIID. Установлено на примере по |
||||||||||||||||||
белками,участвующимиврепарацииДНК(т.н. |
крайней мере нескольких генов, что это |
||||||||||||||||||
эксцизия нуклеотидов). РНК полимераза II |
фосфорилирование освобождает РНК- |
||||||||||||||||||
cвязана еще с группой белков, которые могут |
полимеразуIIипозволяетначатьтранскрипцию |
||||||||||||||||||
разрушать |
нуклеосомы и |
называются |
(Ðèñ. 7.36). |
|
|
|
|
|
|||||||||||
семействомSWI/SNF. |
|
|
|
|
Всего в состав комплексов общих |
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
ПроцесссборкикомплексапоказаннаРис. факторовтранскрипциииРНК-полимеразыII |
||||||||||||||||||
7.36. |
|
|
|
|
|
|
|
|
входит до 50 белков, иногда эти комплексы |
||||||||||
Формирование белкового комплекса на |
|||||||||||||||||||
называюттранскриптосомами(Рис.7.37). |
|||||||||||||||||||
промоторнойпоследовательностиначинаетсяс |
|
Две другие РНК-полимеразы, I и III, |
|||||||||||||||||
того, что фактор транскрипции TFIID |
|
||||||||||||||||||
найденные у эукариот, также требуют для |
|||||||||||||||||||
связывается с TATA-доменом, который |
активирования набора общих факторов |
||||||||||||||||||
расположенвышеточкиинициациитранскрипции транскрипции.Сниминевсеясно.Установлено примернона25нуклеотидов.TFIIDсостоитв лишь,чтобелкиTBPтребуютсядлявсехтрех своюочередьизмногихсубъединиц.Теизних, полимераз.Другиефакторыотличаютсяоттех,
которыеответственнызараспознаваниеTATA- |
что были описаны в комплексах с РНК- |
|
последовательности,называютсяTBP(TATA- полимеразойII. |
||
bindingproteins).КомплексTBP+TAFслужитв |
Кроме промотора в контрольной зоне |
|
качестве сайта связывания фактора TFIIB, |
||
находятсярегуляторныепоследовательности |
||
которыйпривлекаетРНК-полимеразуIIиTFIIF, |
(Рис. 7.38), с которыми связываются |
|
177
Глава 7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Структура гена |
|
Рисунок 7.37 |
|
|
|
|
|
|
точки инициации транскипции. В результате |
||||
Энхансер |
|
|
|
|
|
|
тепловогошокабелокHSFмодифицируетсяи |
||||
|
|
|
|
CTD |
|
связывается с промотором гена hsp. Это |
|||||
|
+ + |
|
|
|
активирует РНК-полимеразу II, либо |
||||||
AR |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
Srb |
|
Swi/Snf |
|
воздействуянаТАТА-домен,либоосвобождая |
||||
|
Taf |
F |
Gal11 |
Sin4 |
|
гипотетическийбелок“Х”,блокирующийРНК- |
|||||
|
|
H |
полимеразуII(см.Рис.7.41). |
|
|||||||
|
|
|
Rgr1 |
|
|
||||||
|
TBP |
B |
Pol II |
E |
|
Некоторые из генов hsp индуцируются |
|||||
|
A |
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
такжегормонами.Соответственно,промоторы |
|||||
|
TATA |
|
Инициатор |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
ÐÍÊ |
|
этихгеноворганизованысложнее(Рис.7.42).В |
|||||
|
|
|
|
|
них перемежаются регуляторные элементы |
||||||
Расположение белков в типичном промоторе |
|||||||||||
обоих типов. Повтор (CT)n связывает белок, |
|||||||||||
эукариот (Из: Struhl, 1996). |
|
|
|
|
|||||||
регуляторные белки, необходимые для |
называемый GAGA-фактором. Последний |
||||||||||
контроля процесса образования белкового |
устанавливает и поддерживает состояние |
||||||||||
гиперчувствительностикДНК-азеIдоиндукции |
|||||||||||
комплексанапромоторе. |
|
|
|
|
тепловым шоком, в то время как NS-фактор |
||||||
Ниже приведены примеры организации |
|||||||||||
связывается с элементами HSE в уже |
|||||||||||
регуляторных участков, обнаруженных у |
активированном хроматине и инициирует |
||||||||||
некоторыхгеновэукариот. |
|
|
|
|
транскрипцию. |
|
|
||||
Гены,отвечающиенатепловойшок(см. |
|
|
|||||||||
|
|
|
|
||||||||
Раздел13),имеютвсоставерегуляторнойзоны |
Литература к разделу 7.6.1. |
||||||||||
оттрехдошести“элементовтепловогошока” |
Гвоздев В.А. Механизмы регуляции активности |
||||||||||
(HSE) (Рис. 7.39), которые представлены 14- |
генов |
â |
процессе |
транскрипции. |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||
членнымипоследовательностяминуклеотидов |
|
|
|
1 |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
Соросовский образовательный журнал : |
||||
(Ðèñ. 7.40). |
|
|
|
|
|
|
23-31, 1996. |
|
|
||
Известно,чтогенытепловогошокаочень |
Жимулев И.Ф. Хромомерная организация |
||||||||||
быстро реагируют |
íà |
индуцирующее |
политенныххромосом.Новосибирск,Наука, |
||||||||
воздействие (см. Раздел 13). В соответствии с |
339-354, 1994. |
|
|||||||||
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., |
|||||||||||
таким типом индукции у них устроены |
|||||||||||
регуляторныерайоны(Рис.7.41). |
|
|
|
WatsonJ.D.Molecularbiologyofthecell(Third |
|||||||
|
|
|
edition) Garland Publishing, Inc. New York, |
||||||||
В неиндуцированной тепловым шоком |
|||||||||||
London, 421-432, 1994. |
|
||||||||||
клетке(Рис.7.41а)находятсябелковыефакторы |
|
||||||||||
Arkhipova I.R. Promoter elements in Drosophila |
|||||||||||
HSF, они неактивны и не связываются с |
melanogaster revealed by sequence analysis. |
||||||||||
промоторными HSE-элементами. РНК- |
|||||||||||
Genetics 139: 1359-1369, 1995. |
|||||||||||
полимераза II занимает участок гена в районе |
|||||||||||
|
|
|
|
||||||||
Рисунок 7.38 |
|
|
|
|
|
общие |
|
|
|
|
транскрипционные |
|
|
|
регуляторные белки |
факторы |
РНК-полимераза II |
регуляторные |
|
|
белки |
|||
спейсер |
ÒÀÒÀ |
промотор |
структурная часть |
|
регуляторные |
|
|
ãåíà X |
|
|
|
|
|
|
последовательности |
|
|
|
|
|
|
|
РНК-транскрипт |
|
Схема организации контролирующего района типичного гена эукариот, состоящего из |
||||
регуляторных последовательностей и промотора. |
|
|
|
|
178 |
|
|
|
|
Структура гена |
|
|
|
|
|
Глава 7 |
Рисунок 7.39 |
|
|
|
|
|
|
-1917 |
-400 Xba |
-300 |
-200 |
-100 |
Xba +1 |
+632 |
|
HSE6 |
HSE4-5 |
HSE3 |
HSE1-2 |
|
|
|
(CT)n |
|
(CT)n |
TATA |
|
|
|
1 |
|
2 |
|
3 |
|
Участок контролирующего элемента гена hsp26 у Drosophila melanogaster. Показаны: TATA- |
||||||
домен, HSE-элементы (CT)n – GAGA-сайт. 1 и 3 – дистальный и проксимальный участки |
||||||
гиперчувствительности к ДНК-азе I. 2 – участок формирования нуклеосомы (Из: Lu et al., 1993). |
||||||
Рисунок 7.40 |
|
|
|
|
inchromatinstructureandtranscriptionalactivation |
|||||||
C--GAA--TTC--G |
|
of the Drosophila hsp26gene. Mol. Cell. Biol. |
||||||||||
|
13: 2802-2814, 1993. |
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley |
||||||
|
|
|
|
|
|
Longman,Ins,MenloPark,California,379-417, |
||||||
Последовательностьнуклеотидов,составляющая |
1998. |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
контролирующийэлементHSEудрозофилы(Из: |
StruhlK.ChromatinstructureandRNApolymeraseII |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
Lis et al., 1990, в кн. Жимул¸в, 1994, стр. 339). |
|
connection:implicationsfortranscription.Cell 84: |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
Hanna-Rose W., Hansen U. Active repression |
179-182, 1996. |
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
mechanismsofeukaryotictranscriptionrepressors. |
7.6.2. Метод репортерных |
|
||||||||||
Trends is Genetics 12: 229-234, 1996. |
|
генов для изучения |
|
|
||||||||
LewinB.GenesV.OxfordUniversityPress.Oxford,New |
|
|
||||||||||
York, Tokyo, 385, 1994. |
|
|
контрольных участков генов |
|||||||||
LuQ.,WallrathL.L.,GranokH.,ElginS.C.R.(CT)n(GA)n |
Одним из |
подходов |
к изучению |
|||||||||
repeatsandheatshockelementshavedistinctroles |
||||||||||||
|
|
|
î ð ã à í è ç à ö è è |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Рисунок 7.41 |
|
|
|
|
|
|
|
регуляторной части |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
HSF |
|
|
|
|
|
|
генаявляетсяметодика |
||||
|
|
|
|
|
|
|
репортерных генов, |
|||||
HSF |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
-90 |
-70 |
-50 |
TATA |
+1 |
|
|
+70 |
|
разработанная |
â |
||
ÐÍÊ-ïîë II |
|
лабораторииВ.Геринга |
||||||||||
à |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
HSE2 |
HSE1 |
Тепловой шок |
|
|
|
|
|
в 1985 году. Впервые |
||||
|
|
|
“X” |
|
|
|
|
ýòîò |
метод |
áûë |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
примененнагенеfushi |
|||
-90 HSF* |
|
|
|
+1 |
|
|
|
|
tarazu (ftz) и состоит в |
|||
|
HSF* |
TATA |
|
ÐÍÊ-ïîë II |
|
следующем: авторы |
||||||
á |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
имелифрагментДНК, |
|||
Схема изменений в компонентах промоторной зоны гена hsp70 |
â |
котором |
||||||||||
дрозофилы во время индукции тепловым шоком (Из: Rougvie, Lis, 1988 |
ð à ñ ï î ë à ã à ë à ñ ü |
|||||||||||
в кн. Жимул¸в, 1994, стр. 354). |
|
|
|
|
|
кодирующаячастьгена |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
Рисунок 7.42 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
ECR |
|
|
|
|
|
2 |
1 |
|
|
TATA |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
HSE |
|
4 |
3 |
|
|
|
2 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Регуляторные последовательности в 5' нетранскрибируемом районе гена hsp23 у дрозофилы (Из: Mestril et al., 1986, в кн. Жимулев, 1994, стр. 343), ECR - участки связывания с экдистеронрецепторным комплексом, HSE - элементы связывания фактора теплового шока.
179
Глава 7 |
|
|
Структура гена |
|
|
|
|||
|
искуственно созданный “ген”, состоящий из |
|||
Рисунок 7.43 |
||||
|
регуляторнойчастиftzигенаlacZ,проработает, |
|||
|
азатеморганымухипроинкубироватьсX-gal, |
|||
|
клетки, в которых такой “ген” был активен, |
|||
|
окрасятся в синий цвет - цвет |
|||
|
водонерастворимогопродуктарасщепленияX- |
|||
|
gal. В данном случае ген lacZ ведет себя как |
|||
|
репортер,сообщающийоработерегуляторной |
|||
|
частигенаftz.Оказалось,чтоутрансформантов, |
|||
|
содержащихвгенометранспозон,“ген”ftz/lacZ |
|||
|
функционирует в тех же самых клетках, что и |
|||
|
нормальныйгенftz. |
|
|
|
|
Теперь можно попытаться узнать какие |
|||
|
именноучасткирегуляторнойчастигенаболее |
|||
|
необходимы |
äëÿ |
нормального |
|
|
функционирования. С помощью особых |
|||
|
приемов можно удалять разные части |
|||
Локализация клеток (окрашены синим) |
регуляторногофрагмента,объединятьихсlacZ, |
|||
трансформировать и следить за экспрессией |
||||
имагинальных дисков дрозофилы, в которых |
||||
lacZ. |
|
|
||
экспрессируется ген lacZ. |
|
|
||
НаРис.7.44показанырезультатытакого |
||||
|
||||
|
||||
ftz.Болеетого,выше5’концакодирующейчасти экспериментасгеномhunchback.Внормальном
гена был расположен еще один отрезок ДНК |
развитии белковый продукт гена hunchback+ |
|||||||||||
длиной 6.1 т.п.н., содержащий регуляторную |
распределяется в передней части эмбриона |
|||||||||||
частьгена.Еслитрансформироватьмутантовftz |
(верхний ряд на Рис. 7.44). Используя |
|||||||||||
транспозоном, содержащим весь |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Рисунок 7.44 |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
фрагмент ДНК, у потомков |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
hunchback + |
||||||
формируется |
нормальный |
|
|
|
|
|
|
|||||
фенотип. Это значит, что и |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
регуляторная,иструктурнаячасти |
-802 |
-318 |
|
TATA lacZ |
||||||||
генафункционируютнормально. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
-195 |
-55 |
|
|
|||||||
После этого авторы удалили |
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
TATA |
|||||||
кодирующую |
часть |
ftz, |
hb |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
присоединили |
íà |
åå |
место |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
кодирующую часть гена lacZ, |
|
|
|
|
|
TATA |
||||||
hb 263 |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
выделенногоизбактерииE.coli,и |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
трансформировали |
|
ýòèì |
|
|
|
|
|
TATA |
||||
транспозоном |
|
эмбрионы |
hb 123 |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
дрозофилы.Следуетотметить,что |
hb 123 |
|
|
|
TATA |
|||||||
ген lacZ кодирует фермент β - |
|
|
|
|||||||||
повторенный |
|
|
|
|
|
|
||||||
галактозидазу,расщепляющуюβ - |
дважды |
|
|
|
|
|
|
|
||||
галактозиды. |
 |
условиях |
Локализация регуляторной зоны гена hunchback с помощью |
|||||||||
эксперимента можно подобрать |
гена-репортера lacZ. (Из: Lawrence, 1992, стp. 53). В верхней |
|||||||||||
особый галактозид, например, |
строке красным цветом показано распределение продукта |
|||||||||||
вещество, называемое X-gal, в |
ãåíà hunchback+ в передней части эмбриона. Строки 2-6 |
|||||||||||
результатерасщеплениякоторого |
показывают, как изменяется распределение продукта гена |
|||||||||||
образуютсясоли,имеющиесинюю |
lacZ при удалении той или иной части регуляторной зоны. |
|||||||||||
окраску и нерастворимые в воде |
Цифры -805, -318, -195, -55 обозначают порядковый номер |
|||||||||||
(Ðèñ. 7.43). |
Теперь, |
åñëè |
нуклеотида, считая нулевым первый нуклеотид гена lacZ. |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
180
Структура гена |
Глава 7 |
|
|
трансформацию,установили,чторегуляторная последовательностьгенаhunchbackдлиной747 п.н.вышерепортераlacZ (второйряд),вполне достаточна для почти нормального распределенияпродуктаlacZ.Впоследующих экспериментахудалосьпоказать,чтофрагмент длиной 263 п.н. (между -55 и -318) абсолютно небходимдляэкспрессииlacZ(третийряд).Если добавитьтолькоэтотфрагмент,егодостаточно для почти нормальной экспрессии lacZ (четвертый ряд). Другие варианты состава регуляторной зоны дают разные промежуточныеуровниактивности“репортера” (ряды 5 и 6 на Рис. 7.44).
Литература к разделу 7.6.2.
Lawrence P.A. The making of fly. Oxford, Blackwell ScientificPublications,1-228,1992.
7.6.3. Энхансерные участки гена
Хотя промоторные элементы являются решающимивосуществлениитранскрипции,в целом, для того, чтобы она осуществлялась максимально эффективно, необходимы энхансерныеэлементы.
В 1979 году было установлено, что последовательности ДНК, расположенные за тысячи пар нуклеотидов от промотора эукариотическогогена,могутактивироватьего транскрипцию. Сейчас известно, что эти энхансерные (т.е. усиливающие) последовательности служат в качестве специфическихучастков(сайтов)связывания особых регуляторных белков, активирующих процесстранскрипции.Этоттипконтролягенной активности на расстоянии является скорее правилом, чем исключением. Как эти белки могутдействоватьнабольшихрасстояниях?
Согласно самой простой модели, ДНК между энхансером и промотором образует петлю, в результате чего белки, связанные с энхансером,непосредственновзаимодействуют соднимизобщихфакторовтранскрипцииилис молекулойсамойРНК-полимеразы(Рис.7.37).
Число общих факторов транскрипции невелико,хотяониоченьобильнопредставлены вклетке,посколькусвязываютсяспромоторами всех генов, транскрибируемых РНК-
полимеразой II. Кроме этого, в клетке существуют тысячи различных других регуляторных белков, связывающихся с регуляторнымисайтамиконтролирующейзоны. Их наборы различаются в разных клетках и у разных генов. Каждый из этих белков представлен малым числом молекул и большинство их распознают особую, специфическую только для них, последовательность нуклеотидов в регуляторныхсайтахгенов.Спомощьюбелковрегуляторов каждый ген специфически включаетсяиливыключается,т.е.фактически каждому органо– или тканеспецифическому гену “соответствует” “свой” энхансер (Рис. 7.45).
Существуют также зоны ДНК, ответственныезарепрессиюактивностигенов
–сайленсеры.
Очень часто для понимания процессов развития необходимо выявить максимальное числогенов,функционирующихвтойилииной ткани. В лаборатории В. Геринга в 1987-1989 г.г. был разработан метод трансформации, позволяющий выявлять гены, вовлеченные в развитие. Геринг и его коллеги создали транспозон, в котором ген lacZ помещен под контрольслабогопромотора,имеющегосявРэлементе.Еслитакойтранспозонвстраивается
âокрестностиэнхансерногоэлементакакого-то гена,функционирующегоудрозофилывходе нормальногоразвития(элементЕнаРис.7.46б), этот энхансер может активировать слабый промоторР-элементаисоединенногоснимгена lacZ(Рис7.46а).Врезультатеактивированиягена lacZиокраскивнутреннихоргановдрозофилы реактивом Х-gal можно обнаружить клетки синегоцветаи,такимобразом,установить,что
âзоневстраиваниятранспозонавмолекулеДНК находится ген, активно функционирующий в данной клетке. Используя перемещения транспозонаисобираятелинии,вкоторыхlacZ активен,можновыявитьвсеилисущественную частьгенов,активнофункционирующихвтой илиинойдифференцированнойткани.Наличие
âсоставетранспозонаплазмидыpBluescript(см. Рис.7.46а)даетвозможностьклонироватьиген, находящийся под контролем энхансера, и сам
181