Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 7-3ver7

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.45

ð à ç ë è ÷ í û õ

lethal of scute

расстояниях

äî

à

achaete

scute

scute

scute

промотора.Однако,в

отличиеотэнхансера,

y4

S1

4V1

7 9HS2

UAS

íå

могут

8

19

260-1

функционировать

L8

6

когда локализованы

S1

S2

íèæå

промотора.

L8

V1

H

7

U

A

S

-

80

70

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

á

последовательности

yellow

ac

sc

l’sc

T2

ase

T1

активируются,когдас

Äèñê

ними связываются

белки GAL4 (рис.

â

CNS

7.47).

PNS

Â

последние

Локализация на молекулярной карте энхансеров генного комплекса

несколько

ëåò

появился

новый

Achaete-Scute Complex у дрозофилы. а – фенотипическая карта комплекса.

методактивирования

б – молекулярная карта. Под горизонтальной линией в виде стрелок

í à ï ð à â ë å í í î é

изображены гены. в – локализация энхансеров в клетках крылового и

экспрессии генов у

магинального диска, и эмбриональных центральной (CNS) и

периферической (PNS) нервных систем (Из: Modolell, Campuzano, 1998).

дрозофилы.Сутьего

энхансер.Этотметодимеетназваниеenhancer

заключается в том,

÷òî

исследователи

создают

äâå

trapping.

трансформированные линии мух, в одну из

Ó

дрожжей

известны

элементы,

которыхвводитсяGAL4-транспозон,авдругую

функциональнопохожиенаэнхансеры,которые

UAS-транспозон (Рис. 7.48). Для создания

называютсяupstreamactivatorsequences(UAS).

первойлиниивР-элемент,нарядусобычными

Подобно

энхансерам

UAS

могут

маркерами вводится ген, кодирующий белок

функционировать в любой ориентации и на

GAL4. Такой транспозон встраивается в

lacZ

Adh

ry

Bluescript

Рисунок 7.47

-нарис.7.48),сшитыйспромоторомUAS.Когда

UAS - cайт связывания

в результате скрещивания двух линий оба

GAL4

транспозонаобъединяютсявгеномепотомка,

ÄÍÊ

ген GAL4 начинает функционировать в тех

GAL4

клетках,вкоторыхактивенегоэнхансер.Белок

TFIID

GAL4связываетсяспромоторомUAS,который

TFIIB

и“включает”ген“Х”.Приэтоминдукция“Х”

ãåí

TATA

будет совсем не в той ткани, в которой он

Взаимодействие белка GAL4 с участком UAS

активируетсясвоимсобственнымэнхансером,

и транскрипционным

комплексом, в

автой,вкоторойфункционируетэнхансергена

результате чего облегчается добавление к

GAL4 (см. рис. 7.48). Такая экспрессия

комплексу фактора транскрипции TFIIB. Это

называется эктопической, т.е. “не на своем

усиливает скорость транскрипции примерно

месте”. Рассмотрим один из наиболее

â 1000 ðàç (Èç: Alberts et al., 1994, p. 425).

интересных примеров, связанный с

случайныерайоныхромосомдрозофилы,втом

использованиемGAL4-UASтранспозонов.

числе может встроиться под какой-нибудь

В лаборатории В. Геринга (Рис. 7.49)

энхансер, например, под энхансер гена,

заинтересовалисьразвитиемглазудрозофилы

работающего в клетках формирующегося

и некоторых других животных. Мутации

крыла или ноги. Поэтому GAL4 будет

некоторых генов приводят к полному

экспрессироваться в клетках крыла или ноги,

отсутствиюглаз,напримерeyelessудрозофилы.

однаконикакихпоследствийдляэтихклетокне

В результате сопоставления молекулярной

будет, поскольку белок GAL4 может

организациигенаAniridiaучеловека,генаSmall

активироватьтранскрипциюдругогогеналишь

eye у мыши, и eyeless у дрозофилы было

в том случае, если он свяжется с промотором

найдено значительное их сходство. Это тем

UAS,

â

нормальном

развитии

более удивительно потому, что анатомически

функционирующим также только в геноме

глаза у мухи и млекопитающих очень мало

дрожжей. Поэтому и создают вторую линию

напоминают друг друга: всем известный из

дрозофилы,

которую

трансформируют

учебниковпоанатомииглазчеловекаисложный

транспозоном,содержащимиспытуемыйген(Х

глаз, состоящий из 800 отдельных глазков

UAS - Ãåí X

GAL4

Геномный энхансер

GAL4

Ãåí X

UAS

Тканеспецифичная

Активация Гена X

экспрессия

GAL4

Рисунок 7.49

Литература к разделу 7.6.3.

Жимулев И.Ф. Трансформация у дрозофилы -

новый подход в генетике. Соросовский

образовательный журнал, 2000, в печати.

Жимулев И.Ф. Современные представления о

структуре

ãåíà.

Соросовский

образовательный журнал, 2000, в печати.

Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K.,

WatsonJ.D.Molecularbiologyofthecell(Third

edition) Garland Publishing Inc. New York,

London, 425, 1994.

Bellen H.J., O’Kane C.J., Wilson C., Grossniklaus U.,

PearsonR.K.,GehringW.J.P-elementmediated

Вальтер Геринг

enhancerdetection:aversatilemethodtostudy

development in Drosophila. Genes and

ðîä. 1939

Development 3: 1288-1300, 1989.

Bier E., Vaessin H., Shepherd S., Lee K., McCall K.,

(фасеток), собранных в один общий орган

зрения, у дрозофилы. Оказалось возможным

BarbelS.,AckermanL.,CarrettoR.,UemuraT.,

GrellE.,JanL.Y.,JanY.N.Searchingforpattern

получить гибридный генотип - гомозигот по

andmutationintheDrosophilagenomewithaP-

мутации eyeless у дрозофилы, содержащих

транспозоныGAL4иUAS.GAL4находитсяпод

Рисунок 7.50

контролем энхансера, функционирующего в

клеткахразвивающихсяног,крыльевиорганов

головного комплекса. В транспозон UAS на

место гена “Х” встроена ДНК нормального

аллеля гена eyeless+ . В результате

фукционированиягенаeyelessпоявляются,во-

первых,нормальнофункционирующиеглаза,а

также маленькие глаза в разных участках

крыльев, ног, на голове - там, где был активен

энхансер (Рис. 7.50). Затем был сделан еще

болееострыйэксперимент:наместогена“Х”в

транспозонUASвстроилиДНКгенаSmalleye,

выделеннуюизгеномамыши.Иопятьначали

формироватьсясложныеглаза,характерныедля

дрозофилывразныхучасткахтеламухи(Рис.

7.50). Как же могло получиться, что действие

гена,контролирущегоразвитиеодноготипаглаза

Формирование глаз в обычных участках

умыши,привелокразвитиюглазасовершенно

головы и маленьких эктопических глаз на

другого типа у дрозофилы? Согласно

ногах, под крыльями и антеннах у

существующим расчетам, в процессах

трансформированныхдрозофил:эктопический

формирования глаз у животных принимает

глаз на ноге (а), под крылом и на антенне (б);

участие около 2 500 генов, и их действие

дрозофилы

трансформированы

транспозонами, содержащими ген дрозофилы

организовановкаскад.Оказалось,чтовсетри

eyeless+; в и г - развитие нормального и

рассмотренныхвышегена-Smalleyes,Aniridia

эктопического глаза на антенне (г - большое

и eyeless находятся в начале каскада, т.е. они

увеличение); мухи

трансформированы

толькодаюткомандунаначалоразвитияглаза,а

транспозонами, содержащими ген Small eye+,

остальныегены,функционирующиепослених,

выделенный из мыши. а, б - Из: Halder et al.,

ужеопределяют,какойглазбудетсформирован.

1995; 1995; â,ã - Èç: Gehring, 1996.

lacZ vector. Genes and Development 3: 1273-

BEAF-32A(boundaryelement-associatedfactor).

1287, 1989.

Этот белок, по-видимому, связывается с

BrandA.H.,PerimonN.Targetedgeneexpressionasa

палиндромомCGATA(см.Рис.7.51).Полагают,

meansofalteringcellfatesandgeneratingdominant

чтопоследовательностиSCSзамыкаютсдвух

phenotypes. Development 118: 401-415, 1993.

сторон активные гены. Только в пределах

GehringW.J.Themastercontrolgeneformorphogenesis

участка между двумя инсуляторами

andevolutionoftheeye.GenestoCells1:11-15,

энхансерныепоследовательности,связавшись

1996.

с белками-активаторами, могут образовать

HalderG.,CallaertsP.,GehringW.J.Newperspectives

oneyeevolution.CurrentOpinioninGenetics&

петлю и осуществить взаимодействие с

Development 5: 602-609, 1995.

промотором(Рис.7.52).

ModolellJ.,CampuzanoS.Theachaete-scutecomplex

Литература к разделу 7.6.4.

as an integrating device. Int. J. Developmental

Biology 42: 275-282, 1998.

AvramovaZ.,TikhonovA.AreSCSandSCS’“neutral”

O’KaneK.,GehringW.J.Detectioninsituofgenomic

chromatinboundariesofthe87A7locusinvivo?

regulatory elements in Drosophila. Proc. Nat.

Trends in Genetics 15: 138-139, 1999.

Acad. Sci. U.S.A. 84: 9123-9127, 1987.

KellumR.,SchedlP.Aposition-effectassayforboundaries

Wilson C. Pearson R.K., Bellen H.J., O’Kane C.J.

ofhigherorderchromosomaldomains.Cell 64:

GrossniklausU.,GehringW.J.P-element-mediated

941-950, 1991.

enhancerdetection:anefficientmethodforisolating

VazquezJ.,SchedlP.Sequencesrequiredforenhancer

andcharacterizingdevelopmentallyregulatedgenes

blocking activity of SCS are located within two

in Drosophila. Genes & Development 3: 301-

nuclease-hypersensitive regions. EMBO J. 13:

1313, 1989.

5984-5993, 1994.

Zhao K., Hart C.M., Laemmli U.K. Visualization of

7.6.4. Инсуляторы

chromosomaldomainswithboundaryelement-

Прирассмотрениивопросаобэнхансерах,

associated factor BEAF-32. Cell 81: 879-889,

1995.

которыеспособнызасчетпетлисоединитьсяс

любым, даже очень удаленным промотором,

7.7. Структурная часть гена

можно было бы предположить, что любой

конкретный промотор может находится под

7.7.1. Интроны и экзоны

контролемнеограниченногочислаэнхансеров,

разбросанныхповсемугеному.Однакоэтогоне

Приизучениипервичнойструктуры,т.е.

происходит, поскольку в геноме существуют

последовательности нуклеотидов ряда генов

особыеструктуры,называемыеинсуляторами

выяснилось, что в них, наряду с участками,

(от англ. insulate – изолировать, отделять от

кодирующими специфичный для этого гена

окружения). Инсуляторы разграничивают

продукт (полипептид, рРНК, тРНК и т.д.)

соседниегены,блокируявзаимодействиямежду

имеютсяучастки,которыеничегонекодируют,

энхансерамиинеподходящимипрмоторами.

т.е. они подобно межгенным спейсерам

Лучше всего охарактеризованы

(участкам между генами) не содержат

инсуляторныеэлементыSCSиSCS1,ифрагмент

генетической информации. Группы уч¸ных,

длиной в 340 п.н., расположенный в пределах

возглавляемых Р. Робертсом и П.А. Шарпом

ретротранспозонаgypsy.

обнаружили такие расщепл¸нные гены у

Впуфетепловогошока87A7удрозофилы

аденовируса2в1977году.

находятся два гена hsp70, по краям которых

Некодирующие участки получили

расположены два элемента SCS (specialized

названиеинтронов,кодирующие-экзонов.Такой

chromatinsequence)нарасстоянии14т.п.н.друг

тип структурной организации обнаружен для

от друга (Kellum, Schedl, 1991). Каждый

множествагенов,локализованныхвхромосомах

элементSCSзанимаетпримерно350п.н.(Рис.

эукариот,длянекоторыхгеноввнутриклеточных

7.51). Оказалось, что с одним из SCS’–

органеллэукариот-пластидимитохондрий,а

элементов связывается специфический белок

такжедлягеновнесколькихРНК-содержащих

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.51

SCS

87A7

SCS’

87A6

hsp70

hsp70

87A8

ДНКаза I

SAR

ДНКаза I

ДНКаза I

чувствительный

устойчивый

чувствительный

Структура инсуляторов в пуфе 87A7. Hsp70 – два гена, кодирующие белки теплового шока,

SCS и SCS’ – инсуляторные элементы. Внизу в более крупном масштабе показано строение

SCS-элемента: ДНКаза –I – чувствительные участки и мотивы CGATA (Из: Zhao et. al., 1995).

Структура гена

Глава 7

Рисунок 7.53

Дополнение 7.5

95%

Нобелевская премия 1993 года

80

Дрожжи (S. cerevisiae)

была присуждена Р. Дж. Робертсу

60

и Ф. А. Шарпу (Richard J. Roberts,

40

Philip

A. Sharp) çà

открытие

расщепленных генов.

20

измененияинициацииитерминации

30

Дрозофила (D. melanogaster)

транскрипции,атакжесплайсинга.

20 17%

Использование альтернативных

10

промоторов может изменять 5'

конец,

использование

15

Млекопитающие

альтернативных терминаторов

10

может

изменять

3'

конец

6%

транскрипта.Этиизменениямогут

5

организоваться

только

1 2 3 4 5

6 7

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 <30<40<50>60

инициирующими

èëè

Распределение частот генов имеющих различные числа

ò å ð ì è í à ë ü í û ì è

экзонов (Из: Lewin, 1994, p. 684). Ось абсцисс: число экзонов

последовательностями мРНК.

в одном гене. Ось ординат: частота встречаемости таких

генов (%).

Иногда

изменения

â

нетранслируемой 5’ лидерной

последовательностейгуанин-тимин,ана3'конце

последовательностиили3’нетранскрибируемой

-аденин-гуанин.

Последовательности нуклеотидов в

Рисунок 7.54

экзонах консервативны, а в интронах сильно

20

варьируют. Иногда экзон одного гена может

Грибы

бытьгомологичнымэкзонудажедругогогена.

10

Например,дваβ -глобиновыхгенамышиимеют

по три гомологичных экзона в каждом гене.

30

Между интронами этих генов гомология не

Насекомые

найдена. Связано это с тем, что интроны

20

эволюционируют значительно быстрее, чем

экзоны.Присравненияхпоследовательностей

10

нуклеотидов в одних и тех же генах у разных

30

видов,находятбольшуюгомологиювэкзонах

Растения

(Èç: Lewin, 1994, pp. 688-689).

20

Литература к разделу 7.7.1.

10

York, Tokyo, 688-689, 1994.

30

Позвоночные

7.7.2. Альтернативный

20

сплайсинг

Внекоторыхслучаяхваминокислотные

10

последовательности транслируются не все

<50 <100<150<200<250 <300<400<500<600>600

существующие экзоны. В результате с одного

Длины экзонов в генах у разных

генасчитываетсяболееодноготипамРНК.

представителей животного и растительного

На Рис. 7.57 суммированы возможные

мира (Из: Lewin, 1994, p. 683). Ось абсцисс:

механизмыобразованиямногихтиповмолекул

длина экзона в нуклеотидах. Ось ординат:

частота встречаемости (%).

РНК, считываемых с одного гена: за счет

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.55

Рисунок 7.56

20

Экзон 1

Интрон 1

Экзон 2

Интрон 2 Экзон 3

ÄÍÊ

16

Синтез РНК

ÐÍÊ

12

Сплайсинг

8

ìÐÍÊ

Синтез белка

4

<0.1<0.2<0.5 <1

<2

<5

<10 <25 <50<100

Белок

Длиныинтроноввгенахпозвоночных(Из: Lewin,

1994, p. 683). Ось абсцисс: длина интрона в т.п.н.

Индивидуальные кодирующие районы разделены в гене

Ось ординат: частота встречаемости (%).

Процесс передачи информации от ДНК до

трэйлерной последовательности могут иметь

белка, кодируемого расщепленным геном

регуляторныепоследствия.

(Lewin, 1994, p. 150).

На Рис. 7.58 представлена схема

приводит к отделению экзона 1 от молекулы

альтернативного сплайсинга в гене BR-C у

дрозофилы.Весьгензанимаетоколо120т.п.н.,

РНК,содержащейинтрониэкзон2(Рис.7.60а).

внемвыделяют10экзонов.Обнаруженоболее

Свободный5’конецинтронаобразуетпетлюи

15типовразличныхмРНК.

соединяется с нуклеотидом А, входящим в

последовательность, называемую участком

Другойтипальтернативногосплайсинга,

разветвления (branch-point sequence) и

когдаодингенфункционируетфактическикак

расположенную выше 3’ конца интрона. Эта

два(Рис.7.59).Показаныдватранскрипта:Е74А

петлеобразнаяструктураназываетсялариатом.

иЕ74В,синтезирующиесяодновременносдвух

Вклеткахмлекопитающихучастокразветвления

разныхпромоторов.

содержит консенсусную последовательность

Альтернативный сплайсинг играет

YNCURAY,гдеY–пиримидин,R–пурин,аN–

огромную роль в генетическом определении

любоеоснование.КлючевойA-нуклеотидвэтой

ïîëà (ñì. Ðèñ. 13.6).

последовательностирасположенвположении

Íà

Ðèñ.

7.60

представлена

18-28п.н.вышеот3’концаинтрон(Рис.7.60б).

последовательность событий при сплайсинге

Удрожжейэтойпоследовательностьюявляется

двухэкзонов(1и2)ивырезанииинтронамежду

UACUAAC.

ними. Первым шагом в сплайсинге является

Интронудаляетсявформелариата(Рис.

7.60в). Сплайсинг происходит в особых

расщепление в 5’ положении интрона, что

Âèäû

Среднее число

Средняя длина

Средняя длина

экзонов

ãåíà (ò.ï.í.)

ìÐÍÊ (ò.ï.í.)

Saccharomyces cerevisiae

1

1.6

1.6

Грибы

3

1.5

1.5

Cenorhabditis elegans

4

4.0

3.0

Drosophila melanogaster

4

11.3

2.7

Êóðû

9

13.9

2.4

Млекопитающие

7

16.6

2.2

комплексах сплайсинга,

Рисунок 7.57

называемыхсплайсеосомах,

Промоторы Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Экзон 5 Терминаторы

состоящих из пре-м РНК,

1

2

3

1

2

3

связанной с частицами

Использование альтернативных промоторов

малых

ядерных

Экзоны

1

2

3

4

5

рибонуклеопротеинов (SN

Промоторы 2

3

RNP,

иногда

ученые

называют

èõ

snurps).

Модель формирования

Использование альтернативных терминаторов

сплайсеосомы ивырезания

1

2

3

4

5

интронапредставленанаРис.

7.61 (Russell, 1998, p. 398-

399).

1 2 Терминаторы

Альтернативный сплайсинг

Литература к

1

2

3

5

разделу 7.7.2.

1

4

5

2

Терминатор

Гвоздев

В.А. Регуляция

2 Терминатор

активности генов при

Схема возможных вариантов альтернативного сплайсинга (Из:

созревании клеточных

Lewin, 1994, p. 688).

ÐÍÊ.

Соросовский

12

функциональный белок (См. детали: Prescott,

образовательный журнал

: 11-18, 1996.

Жимулев И.Ф. Хромомерная организация

1992).

политенныххромосом.Новосибирск,Наука,

α

Ещ¸болеевпечатляетреорганизациягена

284-293, 1994.

ТВР, который в микронуклеусе содержит 14

LewinB.GenesV.OxfordUniversityPress.Oxford,New

экзонов,расположенныхвследующемпорядке:

York, Tokyo, 150, 687-688, 1994.

1, 3, 5, 7, 9, 11, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, à

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley

нормальный по нумерации порядок экзонов

Longman,Ins,MenloPark,California, 398-399,

образуется в созревшем макронуклеусе (Рис.

1998.

7.62).

инфузорий происходит

Рисунок 7.58

удаление внутригенных

à 100

120

140

160

180

200

220 ò.ï.í.

последовательностейбез

синтеза РНК. Более того,

á экзоны

1

2

345

6

7

8

9

10

происходитперестановка

z1

z2 z3

экзонов.

Òàê,

â

коровый

â

экзон

микронуклеарной ДНК

экзоны гена актина I у

A n

Oxytricha

nova

A n

расположены

â

последовательности:3,4,

6, 5, 7, 9, 2, 1, 8. После

A n

удаления

“интронов”

A n

экзоны

занимают

Организация транскрипции гена BR-C у D. melanogaster (Из: DiBello

положениеврядус1по9

et al., 1991, в кн. Жимул¸в, 1994, стр. 284); а - физическая карта

и только

такая

èõ

гена (от 100 до 220 т.п.н.); б - расположение экзонов (1-10) на

последовательность да¸т

физической карте; в - различные транскрипты, возникающие за

счет альтернативного сплайсинга.

Глава 7

Структура гена

Рисунок 7.59

5’ 0

10

20

30

40

50

60 ò.ï.í. 3’

E74A

E74B

Структура гена Е74, расположенного в пуфе 74EF (Из: Karim, Thummel, 1991, в кн. Жимулев,

1994, ñòð. 293).

Литература к

Рисунок 7.60

разделу 7.7.3.

ïðå-ìÐÍÊ

Prescott D.M. The unusual

5’ Экзон 1 GU

Интрон

Y N C U R A Y

AG Экзон 2 3’

organizationandprocessing

Последовательность в точке ветвления

Разрезание 5’ экзон-интронного

“Лассо”

of

genomic

DNA in

соединения и образование

структуры “лассо”

hypotrichous

ciliates.

Точка ветвления

GU

Trends in Genetics 8:439-

5’

Экзон 1 OH 3’

Y N C U R A Y

AG Экзон 2 3’

445, 1992.

PrescottD.M.TheDNAofciliated

Разрезание 3’ экзон-интронного

соединения и лигирование

protozoa. Microbiol. Rev.

двух экзонов

58: 233-267. 1994.

GU

7.7.4. Локализация

Y N C U R A Y

AG

+

генов в интронах

5’ Экзон 1 Экзон 2 3’

Винтронахнекоторых

Процесс удаления интрона из молекулы пре-мРНК (Из: Russell,

геноврасполагаютсядругие

1998, p. 398).

гены(Рис.7.63-7.65).Порезультатампроекта

7.7.5. Изучение структурной

«Геном дрозофилы», 8% генов у этого вида

части гена с помощью

располагаются в интронах других генов

трансформации

(Ashburner,1999).