Подготовка у универсиаде 2012 / Генетика (Жимулев) / 5ver7
.pdf
Глава 5 |
Генетический анализ |
|
|
Рисунок 5.22
Схема общей трансдукции между линиями E.coli. а) Клетка дикого типа, инфицированная фагом P1;
б) ДНК клетки-хозяина деградирует в ходе литического цикла; в) в ходе сборки фаговых частиц некоторые фрагменты бактериальной хромосомы включены в некоторые фаги-потомки, что потом приведет к трансдукции; г) лизис;
д) трансдуцирующий фаг инфицирует ауксотрофную бактерию-реципиента;
е) двойной кроссинговер приводит к обменам донорного гена a+ b реципиентного гена a-; ж) образование стабильного трансдуктанта a+ (Èç: Russell, 1998, p. 241).
Позжебылвыявленитретийполовойтип, определяющий высокую частоту рекомбинации - Hfr (High frequency recombination).Клеткиэтоготипавозникаютв культурахF+.
Скрещивания F- Ч Hfr дают особенно высокий процент рекомбинантов - 1 на 10 исходныхклеток(вскрещиванияхF- × F+ -1íà 104 исходныхклеток).
Скрещивания F- × F+ показывают, что факторфертильности(F-фактор)передаетсяс
высокойчастотойнезависимо(автономно)от остальных генов. Клетки Hfr теряют способностькавтономнойпередачеF-фактора. Генетическийанализпоказал,чтовлинииHfr факторфертильностипереда¸тсясцепленнос другими генами и занимает определ¸нный локус в бактериальной хромосоме. Таким образом, F-фактор, если он присутствует в клетке, вед¸т себя двояко: как автономная цитоплазматическаячастица(вклеткахF+)èëè
102
Генетический анализ
Рисунок 5.23
Конъюгация у E. coli. Электронная микрофотография F+ клетки (слева), связанной с F- клеткой (справа) половой ворсинкой - F- пилем. (Из: Russell, 1998, p. 224).
каклокусхромосомы(вклеткахHfr).F-фактор отсутствуетвF- клетках.
F-фактор несет гены, контролирующие образованиепилейиспособностьк их переносу в другие бактерии.
Позднее F-фактор стали называть плазмидой (Рис. 5.24) - кольцевой молекулойДНК,реплицирующейся
âклетке автономно от хромосом и содержащей некоторое число генов.ОнабылаоткрытаУ.Хейсом
â1952 ãîäó.
F-факторидругиеплазмиды, способные находиться в клетке в свободном состоянии либо интегрироватьсясе¸хромосомой, называюттакже эписомами.
F-фактор - это крупная плазмида.Длинае¸ДНКсоставляет около 100 т.п.н. (Рис. 5.24).
В настоящее время в плазмиде F идентифицировано около 20 генов, контролирующих различные этапы коньюгации. Большая часть этих генов образует единый оперон traY-Z (tra - transfer - перенос) длиной около 30 т.п.н.
F--штамм E. coli не несет F- фактора,номожетприниматьегоот донора. Такие штаммы называют реципиентными или женскими. В мужской клетке F-фактор может находитьсявдвухальтернативных состояниях:вавтономном,когдаон
Глава 5 |
Генетический анализ |
|
|
Рисунок 5.25
Хромосома
бактерии
à |
á |
F + |
F - |
Hfr |
F + |
F фактор |
|
|
|
Hfr |
F - |
Часть ДНК фактора F с последующими генами бактерии-донора
Рекомбинация между донорной и реципиентной хромосомами
F + |
F + |
Передача генетического материала в результате конъюгации у E. coli. а - Передача F фактора от донора к реципиенту в скрещивании F- × F+.
б - Образование линии Hfr в результате интеграции F фактора и передачи бактериальных генов от донорных к реципиентным клеткам в ходе скрещивания F- × Hfr (Èç: Russell, 1998, p. 232).
последовательностями ДНК - IS элементами (см. Раздел 6.7).
Начало коньюгационного переноса связано с разрезанием одной из нитей ДНК плазмиды F в локусе oriT, расположенном передгенами tra-оперонаиориентированном
такимобразом,что tra-областьпереноситсяв реципиентнуюклеткупоследней.Этотнадрез осуществляется сайт-специфичной эндонуклеазой,кодируемойгенамиtraYиtraZ. РаскручиваниедуплексаДНКпроисходитпод действием фермента ДНК-геликазы,
104
Генетический анализ |
|
|
|
Глава 5 |
||
|
|
|
||||
кодируемойплазмиднымгеномtraI.Фермент |
На Рис. 5.27 показано расположение |
|||||
движется по молекулеДНКвнаправленииот |
некоторых генов у E. coli. За точку отсчета |
|||||
5' к 3' - концу и раскручивает ее со скоростью |
принято начало переноса маркера thr+ â |
|||||
около 1200 п.н. в 1 секунду. Освободившийся |
скрещиваниях F- Ч Hfr H. Единицей карты |
|||||
в результате надрезания и раскручивания 5' - |
служит минута, т.е. количество ДНК, |
|||||
конецоднойизцепейДНКпереноситсячерез |
передаваемое Hfr клеткой за 1 мин. Цифрами |
|||||
коньюгационную пору в клетку реципиента. |
над внутренним кругом обозначен масштаб |
|||||
ОдновременноэтаДНКреплицируется. |
|
карты в минутах относительно точки O, в |
||||
Процесс |
коньюгации |
можно |
которой расположены три гена, образующие |
|||
использоватьдлягенетическогокартирования |
оперон биосинтеза треонина. Всего на карте |
|||||
(Рис. 5.26 см. след. стр.). Генетический |
показано расположение около 50 генов. На |
|||||
материалпереноситсяотдоноракреципиенту |
внешнемкругестрелкамиобозначеныначало |
|||||
однонаправленно в строгой линейной |
и направление переноса хромосомы |
|||||
последовательности. |
Åñëè |
резко |
(â |
различнымиHfr-штаммами. |
||
специальном аппарате-блэндере) встряхнуть |
ВнастоящеевремянакартуE. coli К12с |
|||||
культурыклеток,вступившихвконьюгацию,то |
помощьюконьюгацииитрансдукциинанесено |
|||||
они разьединяются. В зависимости от |
более 1000 генов, что составляет около 30% |
|||||
продолжительности |
коньюгации |
äî |
еегенетическойемкости.(Из:Алиханяни др. |
|||
встряхивания в F- клетку будет перенесена |
1985, ñòð. 291-302). |
|||||
большая или меньшая часть хромосомы Hfr. |
|
|
||||
Части перенесенной хромосомы могут |
Литература к разделам 5.11. - 5.13. |
|||||
рекомбинировать с гомологичным участком |
Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. |
|||||
хромосомы F-. |
|
|
|
|
Общая генетика. Москва, Высшая школа, |
|
За 1 мин. передается примерно 40 т.п.н., |
261-327, 1985. |
|||||
т.е.около1%длиныбактериальнойхромосомы, |
Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами |
|||||
и следовательно, на перенос всей хромосомы |
селекции. Москва, Высшая школа, 198- |
|||||
E. coli потребовалось бы около 100 мин. |
|
224, 1989. |
||||
|
Лобашев М.Е. Генетика (издание |
|||||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
второе) Ленинград, Изд-во ЛГУ, |
Рисунок 5.27 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
416-453, 1967. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Russell P.J. Genetics. Fifth edition. Addison |
|
|
|
|
|
|
Wesley Longman, Menlo Park, |
|
|
|
|
|
|
California, 225-266, 1998. |
Неполная карта кольцевой хромосомы E. coli штамма K12 (Из: Алиханян и др., 1985, стр. 301).
105
Глава 5 |
Генетический анализ |
|
|
Рисунок 5.26
|
|
|
|
|
Hfr |
|
|
|
|
|
F - |
|
|
|
|
|
|
|
|||
Время |
|
|
|
|
|
|
|
|
gal - |
|
|
ton s |
|
|
|
||||||
переноса |
|
|
|
|
|
|
lac - |
thr |
|
- |
|
azi s |
|||||||||
в минутах gal + |
ton |
r |
|
|
leu |
- |
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Старт |
lac+ |
|
|
|
|
|
azi r |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
thr+ |
|
|
thr+ |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
leu+ |
|
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
|
|
|
leu+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
gal - |
|
|
ton s |
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
lac - |
thr - |
|
azi s |
||||||||||
|
gal |
+ |
|
lac+ |
ton s |
leu - |
thr++ |
||||||||||||||
8 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
tonr |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
leu |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
azi r |
azi |
r |
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
thr+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
leu+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
gal - |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
lac - |
thr - |
|
azi s |
||||||||||
|
|
|
|
|
gal |
+ |
|
|
|
leu - |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
r |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
lac |
+ |
|
azi |
|
|
+ |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
thr |
||||||||||||
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
r |
|
|
|
|
+ |
||||
|
|
|
|
|
ton |
r |
|
|
|
|
|
ton |
|
|
|
|
leu |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
thr+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
leu+ |
|
azi r |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
gal - |
|
|
ton s |
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
lac - |
thr - |
|
azi s |
||||||||||
|
thr+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
leu - |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
gal |
+ |
ton |
r |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
17 |
leu |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
azi |
r |
|
||||||
|
|
|
lac+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
r |
|
|
|
lac+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
azi |
ton |
r |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
thr |
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
leu+ |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
gal - |
|
|
ton s |
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
lac - |
|
thr - |
|
|
azi s |
||||||||
|
|
|
thr+ |
|
|
|
|
|
|
leu - |
|
|
|
|
|
||||||
25 |
|
|
leu+ |
|
|
gal + |
|
|
|
|
|
tonr |
|||||||||
azi r |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
lac |
+ |
|
||||||||
|
|
|
|
gal + |
|
|
|
|
|
|
|
|
azi r |
||||||||
|
ton |
r |
lac |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
thr+ leu+
Передаются
первыми,
+
thrleu+ приняты за нулевую отметку карты
azi r |
thr+ |
||||
leu+ |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
azi r |
thr+ |
|||||
|
leu+ |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
tonr |
|
|
|
||||
lac+ |
azi r |
thr+ |
|||||||
leu+ |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
tonr
gal + |
lac+ |
azi r |
thr+ |
|||||||||
leu+ |
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
tonr
Картирование генов в геноме E. coli в результате скрещивания HfrH thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs × F- thr leu azis tons lac gal strr. Рекомбинанты получаются за счет обмена донорного фрагмента и гомологичного фрагмента реципиента в результате двойного кроссинговера. Через различные промежутки времени после начала скрещивания, конъюгирующие пары разделяют и высевают на селективную среду, чтобы определить какие гены перенесены от Hfr в F- (Èç: Russell, 1998, p. 235).
106