Ініціація реплікації в еукаріотів
Суттєвою відмінністю еукаріотичної системи реплікації є те, що кожна хромосома є полірепліконом: загалом геном, наприклад ссавців, містить близько 40 тис. точок ініціації – ориджинів. Ориджини важко ідентифікувати, оскільки спільних елементів послідовності у них немає, вони лише характеризуються підвищеним вмістом АТ-пар.
Розмір еукаріотичного реплікона варіює від 50 до 200 тис. пар основ, що збігається з розмірами петлевих доменів хроматину. Отже, хроматинова петля – це один реплікон, а ориджин збігається з ділянкою, асоційованою з ядерним матриксом. Ініціація реплікації залежить від мультибілкового комплексу ORC (Origin Recognition Complex), який практично постійно є присутнім на ориджині (рис. 19). При підготовці до реплікації у фазі G1 клітинного циклу відбувається фосфорилювання циклінозалежними кіназами факторів регуляції клітинного циклу cdc6 та cdc45 (cdc – cell division cycle). У результаті ці фактори разом із двома моногексамерами МСМ (яким відводиться роль геліказ) взаємодіють з ORC та індукують локальне плавлення подвійної спіралі. МСМ разом із cdc45 залишаються і далі в основах двох реплікативних вилок. З розплетеними полінуклеотидними ланцюгами взаємодіє RPA, cdc45 рекрутує в кожну реплікативну вилку ДНК-полімеразу α. Остання починає синтез праймера, з основою вилки зв’язується RF-C, який завантажує обруч PCNA, полімераза α замінюється на полімеразу δ/ε (так зване перемикання полімераз). Надалі МСМ продовжує розділення ланцюгів ДНК, а полімераза α здійснює синтез праймерів на ланцюзі, що запізнюється, і кожного разу замінюється на другу копію полімерази δ/ε.
Рис. 9.19. Ініціація реплікації в еукаріотів.
Реплікація ініціюється синхронно на сусідніх 25 – 100 репліконах, які складають так звану реплікативну фабрику. При цьому різні ділянки хроматину реплікуються не одночасно: в останню чергу відбувається реплікація гетерохроматинових зон.
Структурні зміни хроматину під час реплікації
Зрозуміло, що нуклеосоми є суттєвим бар’єром на шляху реплісоми. Попереду реплікативної вилки відбувається декомпактизація хроматинової фібрили й тимчасове видалення відноснолегко взаємодіюючого з ДНК гістону Н1. Нуклеосоми руйнуються у дваетапи (рис. 20): спочатку видаляється димер гістонів Н2А-Н2В, потім найміцніше зв’язаний із ДНК тетрамер (Н3-Н4)2. Процес видалення гістонових комплексів забезпечується активністю комплексів ремоделювання хроматину і присутністю проміжних акцепторів гістонів – гістонових шаперонів. Такі шаперони зв’язують гістонові комплекси, що витісняються реплісомою, а потім виконуютьроль факторів збирання нуклеосом позаду реплікативної вилки. Необхідність таких факторів визначається надзвичайно високою спорідненістю гістонів до ДНК
Рис. 20. Руйнування та відновлення нуклеосом у реплікативній вилці.
До найбільш вивчених факторів збирання нуклеосом, що працюють під час реплікації, відносять, зокрема: NAP1 (Nucleosome Assembly Protein), що має підвищену спорідненість до димерів Н2А-Н2В; CAF1 (Chromatin Assembly Factor) та ASF1 (AntiSilencing Function) – споріднені до гістонів Н3-Н4 і PCNA, за рахунок чого тетрамери (Н3-Н4)2 спрямовуються до основи реплікативної вилки (рис. 20); RSF (Remodelingand Spacing Factor), який є проміжним акцептором гістонів, а також сприяє регулярному розподілу відновлених нуклеосом на ДНК.
Відновлення нуклеосом позаду реплікативної вилки відбуваєтьсятакож у дві стадії: першим на ДНК повертається тетрамер (Н3-Н4)2, який зв’язує два димери Н2А-Н2В. По двох дочірніх ланцюгах ДНК-гістонові комплекси розподіляються випадково, до них додаються гістони, синтезовані в цитоплазмі de novo під час реплікації. Таким чином, «старі» гістони, що несуть на собі певні характерні модифікації, повертаються на ту саму ділянку ДНК обох ланцюгів, на якій вони були присутні на материнській молекулі. До ділянок хроматину рекрутуються відповідні ферменти, котрі здійснюють аналогічні модифікації щойно синтезованих гістонів – патерн модифікацій відновлюється, що сприяє збереженню певного функціонального стану ділянки хроматину в дочірніх клітинах.