Синтез ланцюга, що запізнюється
Лідируючий ланцюг при ініціації реплікації, а кожен фрагмент Оказакі під час реплікації, мають розпочинатися з РНК-праймера. Його синтез здійснює праймаза (білок DnaG E. coli). Праймаза рекрутується до основи реплікативної вилки геліказою (їхній комплекс називають праймосомою), робота праймази стимулюється геліказою та SSB білками. Розпочинаючи від основи реплікативної вилки, праймаза, яка має низьку процесивність, синтезує праймер – фрагмент РНК довжиною ~12 нуклеотидів (рис. 12). Після цього ДНК-полімераза ІІІ, подовжуючи 3′-кінець праймера, починає синтезувати решту фрагмента Оказакі, а праймаза (та сама чи інша) знову зв’язується з геліказою і згодом розпочинає синтез наступного праймера.
Рис. 12. Робота праймази та ДНКполімерази Іпід час руху реплікативної вилки.
На відміну від ДНК-полімерази, праймаза може з однаковим успіхом включати до праймера як дезоксирибоз- так і рибонуклеотиди. Праймер є фрагментом саме РНК просто тому, що внутрішньоклітинна концентрація рибонуклеозидтрифосфатів є вищою.
Зрозуміло, що РНК-праймер на початку кожного фрагмента Оказакі має бути замінений на відповідну послідовність ДНК. Цю роботу виконує ДНК-полімераза І (рис. 12): за рахунок своєї 5′-екзонуклеазної активності полімераза видаляє праймер і одночасно, використовуючи 3′-кінець попереднього фрагмента Оказакі, подовжує його, заповнюючи прогалину. Після здійснення останньої операції між двома фрагментами Оказакі залишається одноланцюговий розрив (рис. 12, 13) – ДНК-полімераза не може його зшити, оскільки здатна тільки переносити нуклеотиди з NTP на 3′-кінцеву ОН-групу. Утворення фосфодіефірного зв’язку між сусідніми фрагментами Оказакі, яке потребує джерела енергії, здійснюється в АТР-залежній реакції, яка каталізується лігазою (ligase).
Схему роботи лігази показано на рис. 13. До активного центру ферменту, ковалентно приєднуючись до аміногрупи Lys, переноситься АМР з молекули АТР. Далі АМР приєднується до 5′-кінцевого фосфату в місці розриву (своєрідна активація, що нагадує активацію амінокислоти АРС-азою. Видалення АМР супроводжується утворенням фосфодіефірного зв’язку.
Рис. 13. Схема роботи лігази.
Голофермент днк-полімерази
Голофермент ДНК-полімерази, який є основою реплісоми, містить дві молекули ДНК-полімерази ІІІ (по три субодиниці в кожній – корфермент), дві копії τ-білка, γ-комплекс (п’ять субодиниць) та два β-білка, зв’язані з кожною полімеразою. Призначення компонентів голоферменту – утримання разом і забезпечення координації роботи компонентів реплісоми, підвищення процесивності ДНК-полімерази.
Проблема процесивності вирішується β-білком, який утворює так званий обруч (зажим), що ковзає (sliding clamp). Дві однакові субодиниці обруча, міцно взаємодіючи за принципом «голова до хвоста», утворюють циркулярну тороподібну структуру з отвором приблизно 35 Å у діаметрі (рис. 14). Усередині такого кільця легко розміщується подвійна спіраль ДНК, яка практично не взаємодіє з β-білком. Кільце може вільно рухатись уздовж ДНК, але не може дисоціювати. С-кінцевий гідрофобний хвіст ДНК-полімерази ІІІ довжиною 11 амінокислот взаємодіє з гідрофобним карманом обруча. У результаті формується своєрідний поводок, що допускає певну свободу рухів полімерази, але міцно утримує її на ДНК.
Рис. 14. Обруч, що ковзає, – бактеріальний β-білок (2POL).
Оскільки обруч – білкове кільце, що оточує ДНК, його завантаження на подвійну спіраль виконується АТР-залежним шляхом, ця функція належить γ-комплексу. Відбувається завантаження на гібридній подвійній спіралі РНК-ДНК відразу після закінчення синтезу чергового праймера. γ-Комплекс, що складається з п’яти субодиниць та має U подібну структуру (рис. 15), зв’язує АТР і змінює свою конформацію таким чином, що взаємодіє з обручем, порушуючи його цілісність – розмикаючи кільце. Далі γ-комплекс впізнає дуплекс, що утворений між праймером та матрицею, забезпечуючи посадку відкритого кільця на цю подвійну спіраль. Взаємодія з дуплексом індукує АТР-азну активність γ-комплексу. У результаті гідролізу АТР γ-комплекс втрачає спорідненість до β-білка, що призводить до замикання обруча. Далі γ-комплекс знову зв’язує АТР, проте обруч має вищу спорідненість до ДНК-полімерази, ніж до γ-комплексу: обруч залишається на ДНК і взаємодіє з полімеразою та забезпечує її процесивність.
Головну структурну роль в організації реплісоми виконує τ-білок, котрий взаємодіє з ДНК-полімеразою, геліказою, праймазою та утримує на собі γ-комплекс. Численні взаємодії τ-білка забезпечують функціональну координацію між елементами реплісоми.
Рис. 15. Схема АТР-залежного завантаження обруча, що ковзає, γ-комплексом.
Дві молекули τ-білка взаємодіють між собою і кожна утримує кофермент ДНК-полімерази ІІІ, кожна з яких, у свою чергу, зв’язана з обручем (рис. 16). Одна з полімераз здійснює синтез лідируючого ланцюга, інша – фрагмента Оказакі. Обидві полімерази орієнтовані в реплісомі однаково. Оскільки вони при цьому ведуть синтез на антипаралельних ланцюгах, той, що запізнюється, утворює реверснупетлю: конфігурація реплікативної вилки нагадує тромбон.
На рис. 16 зображено момент, коли праймаза почала синтез чергового праймера, а γ-комплекс – напоготові завантажити черговий обруч. Коли полімераза, яка працює на ланцюзі, що запізнюється, завершить синтез фрагмента Оказакі (зустріне попередній фрагмент), вона втратить свій зв’язок з обручем, але збереже взаємодію з τ-білком.
Втрата спорідненості полімерази до обруча визначається одноланцюговим розривом між фрагментами Оказакі. Новий обруч буде при цьому вже завантажений на черговий праймер, полімераза зв’яжеться з ним і розпочне синтез нового фрагмента Оказакі. Обруч, який щойно втратив зв’язок із полімеразою, провзаємодіє з γ-комплексом – останній працює також і як «розвантажувач» обруча (див. рис. 15), знімаючи його з ДНК і забезпечуючи пізніше його посадку на праймер.
Рис. 16. Схема організації реплісоми.