Вопрос 50 Методы днк-диагностики

ДНК-диагностика - это группа методов, которые основаны на выявлении ДНК возбудителя в забранном у пациента материале.

Методы ДНК-диагностики включают в себя такие методы, как ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ЛЦР (лигазная цепная реакция). Для исследования методом ПЦР может быть забран практически любой материал. На анализ берут по особой методике соскоб из мочеиспускательного канала, влагалища и шейки матки. Также материалом для ПЦР могут служить кровь, моча, мокрота и т. п.

В ходе различных манипуляций, ДНК инфекции (если она присутствует в забранном материале) многократно удваивается, пока количество ДНК не станет равным 10 8 — 10 12 штук. Это количество ДНК становится заметным для оборудования, которое проводит диагностику. Таким образом, ПЦР позволяет обнаружить даже одного возбудителя, даже часть возбудителя в пробирке: если хоть один кусочек ДНК вредоносной инфекции есть, он будет «размножен».

Разновидности методов ДНК-диагностики.

В гуманной медицине используют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.

При прямой диагностике обнаруживают мутации клонированного гена, когда известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК.

Используя прямые методы ДНК-диагностики обнаруживают мутации, изменяющие длину разрезанных фрагментов ДНК, которые выявляют электрофарезом на каком-то из указанных выше геле.

Если мутации известны, то их выявляют с помощью ферментов-рестриктаз, которые распознают строго определённые нуклеиновые последовательности.

Использование ферментов бактериального происхождения – рестриктаз позволяет разрезать двойную нить ДНК в определённых последовательностях из 4-8 нуклеотидов. Разрезанные участки мутантной ДНК, отличающиеся по длине от нормальных участков. Разница в размерах мутагенных и нормальных участков ДНК выявляется методом электрофареза на агарозном или полиакриламидном геле.

Для выявления точечных мутаций используют аллельспецифическую полимеразную цепную реакцию, позволяющую многократно увеличивать уникальную последовательность ДНК с последующим выявлением мутации.

Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при наследственных заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается повреждением различных генов, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые методы.

Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу нуклеотидных поворотов). На основании изменчивости состава маркеровых участков ДНК дифференцируют материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни (маркер и ген близко располагаются друг к другу).

При проведении косвенных методов ДНК-диагностики исследованных болезней осуществляют те же этапы подготовительных операций, что и при осуществлении прямых методов ДНК-диагностики. Методами ДНК-диагностики широко пользуются в зоотехнической практике.

Вопрос 51 Генотерапия — совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций.

Ретровирусные векторные системы. Ретровирусы относятся к группе вирусов, РНК-геном которых в инфицированных клетках конвертируется в ДНК. Геном ретровирусов включает три структурных гена, обозначенные как gag, pol и env, фланки- рованых элементами, названными длинными терминальными повторами (LTR, viral long terminal repeat). В LTR содержатся регуляторные элементы, выполняющие важные функции в жизненном цикле ретровируса. Эти повторы необходимы для интеграции ДНК копии генома вируса с геномом хозяина. Они определяют, где начало и где конец вирусного генома. LTR также служат энхансер-промоторными последовательностями, т.е. они контролируют экспрессию генов вируса. Большой геном ретровирусов облегчает генетические манипуляции.

После инфицирования клетки-мишени копия ретровирусной ДНК интегрируется с ее геномом строго определенным образом. Практически все инфицированные клетки способны экс- прессировать гены, привнесенные вирусом. Мощные транскрипционные энхансеры существенно повышают уровень экспрессии генов, клонированных в клетках различных типов. С их помощью можно переместить до 8 т.п.о., что в большинстве случаев более чем достаточно для синтеза крупномолекулярных белков. Весьма удобным для исследователя является то обстоятельство, что ретровирусные векторы можно размножать, достигая их высокой концентрации в небольшом объёме - более 10⁹ вирусных частиц/см³. В опытах по инфицированию ретровирусами мозга, печени, мышц, глаз или клеток панкреатических островков грызунов показана устойчивая экспрессия трансгенов в течение более 6 мес. [9]. Ранние этапы жизненного цикла ретровирусов и векторов на их основе показаны на рис. 1.

Векторы на основе ретровирусов с самого начала их разработки предназначались для введения через неповрежденные клетки за счет механизмов слияния, обеспечиваемых поверхностными белками оболочки вируса. Чувствительность дыхательного эпителия к ретровирусным инфекциям подразумевает возможность ингаляционного пути введения в организм человека векторных конструкций на основе ретровирусов.