7

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы

С2.Б.11 ветеринарная микробиология и микология методические указания

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА.

ВОЗБУДИТЕЛИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА И КОПЫТНОЙ ГНИЛИ.

Специальность 111801 Ветеринария

Уфа 2013

УДК637.12.04/.07:378.147

ББК 36.95+74.58

А 65

Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета биотехнологий и ветеринарной медицины (протокол № 2 от « 04 » сентября 2013 г.)

Составитель: профессор, д-р биол. наук А. В. Андреева

доцент, канд. биол. наук З. З. Ильясова

Рецензент: заведующий кафедрой морфологии, патологии, фармации и

незаразных болезней, д-р ветеринар. наук Гимранов В.В.

Ответственный за выпуск:

зав. кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, д-р биол. наук, профессор Андреева А.В.

г. Уфа, БГАУ, кафедра инфекционных болезней,

зоогигиены и ветсанэкспертизы

Лабораторная работа. Возбудители некробактериоза и копытной гнили.

Цель занятия Изучить морфологию, культуральные, тинкториальные, ферментативные свойства возбудителей некробакте­риоза и копытной гнили, а также лабораторную диагностику и средст­ва специфической профилактики данных заболеваний.

Общие сведения

НЕКРОБАКТЕРИОЗ (фузариобактериоз) - хроническое, антропозоонозное заболевание, характеризующееся поражением ткани конечностей, гнойно-некротическими поражениями кожи, слизистых оболочек, иногда и паренхиматозных органов (генерализованный процесс). Человек заболевает редко (абсцессы на коже рук, в полости рта, легких).

Устойчивость. В фекалиях сохраняется до 50 дней, в моче до 15 суток, в молоке до 40 суток. В почве: летом до 10-15 суток, зимой - до 2 месяцев. При тем-ре 70°С сохраняют жизнеспособность до 10 мин. При кипячение погибают моментально. Чувствителен к раство­рам едкого натра, креалина, лизола, фенола, формальдегида, перманганата калия. Чувствителен к антибиотикам тетрациклинового ряда. Не чувствителен к стрептомицину и к пенициллину.

Патогенность. Болеют все виды сельскохозяйственных жи­вотных, собаки, кошки, гуси, куры, дикие животные. Восприимчив и человек.

Наиболее часто у животных поражаются конечности. Это послераневая инфекция. Возбудитель интенсивно размножается в трав­мированной ткани, токсины его нарушают порозность сосудов - ткани недостаточно снабжаются кровью (кислородом) - создаются анаэроб­ные условия, что способствует еще более интенсивному размножению возбудителя и проникновению в более глубокие ткани. Возбудитель, попадая в кровь, способствует септицемии и поражает внутренние ор­ганы (некротические очаги в печени, селезенке, сердечной мышце).

У собак вызывает образование абсцессов и флегмон на ко­же. У кур отмечаются некротические очаги в глотке, гортани, языке, пищеводе и во внутренних органах.

Морфология. Возбудитель некробактеиоза Fusobacterium necrophorum (род Fusarium) выделен Р. Кохом в 1881г.

В свежих культурах имеет форму палочек средних размеров (2-5 мкм), но чаще расположены в виде переплетающихся нитей, со вздутиями, которые достигают до 350-400 мкм.

В старых культурах и из хронических очагов имеет форму ко­ротких кокковидных палочек, окрашивается неравномерно зернисто, биполярно (по концам). Гр.(-), спор и капсул не образует. Красится по Муромцеву, Романовскому-Гимзе, фуксином Циля, синькой Лёффлера.

Материал для исследования. В лабораторию посылают кусоч­ки пораженной ткани - ее берут на границе некротизированной и здо­ровой, трупы птиц и мелких животных, слюну, мазки. Материал дол­жен быть свежим или консервирован в 30 % глицерине.

Культуральные свойства. Строгий анаэроб. Оптимальная тем­пература роста 34...37°С. На средах Китта-Тароцци - особенно хоро­шо растет при добавлении 10-20 % бычьей сыворотки и 0,5-1,0 % глюкозы. Отличается помутнением, затем выпадением осадка и про­светления среды. Оптимальная рН среды 7,4-7,6.

На глюкозно-кровяном агаре - в строгих анаэробных условиях образует мелкие, круглые или овальные колонии в виде росинок со слабой зоной зеленоватого гемолиза (альфа-гемолиз).

На мозговой среде с сернокилым железом вызывает почернение среды (образует Н₂ S).

Биохимические свойства. Ферментирует с образованием ки­слоты и небольшого количества газа: глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, салицин, левулезу. Не образует сероводород, индол, амми­ак.

Лабораторная диагностика.

1) Бактериоскопия (окраска по Граму, по Муромцеву, по Рома­новскому - Гимзе синькой Лёффлера), зернистоокрашенные нити или тонкие Гр.(-) палочки.

2) Посев на питательных средах (Китта - Тароцци, глюкозо кровавый агар).

3) Биопроба (белые мыши, кролики). Кроликов заражают ап­пликацией патологического материала в подкожный отпрепарирован­ный «кармашек» в области уха или инъецируют подкожно сбоку, мышей в области корня хвоста через несколько дней на месте зараже­ния развивается некротический очаг, который распространяется на соседние ткани и при вскрытии обмечают очаги некроза и во внутренних органах. После гибели лабораторных животных (кролики - через 1...2 мес, мыши - через 8... 14 сут.), их вскрывают и из пораженных внутренних органов производят посевы на питательные среды, гото­вят мазки-отпечатки из пораженного очага.

4) Иммунофлуоресцентный метод. Для ускоренной индикации возбудителя в патологическом материале и при исследовании крови применяют МФА. Для окрашивания используют конъюгаты из моно­сывороток групп А, В, С, Д и др.

5) Для выявления атипичных форм некробактериоза разработа­на РСК с антигеном - экстрактом 3-дневной культуры F. necrophorum в печеночном бульоне. Титр антигена 1:40.

Биопрепараты. Предложены методы химиотерапии (сульфа­ниламидные препараты, а/б тетрациклинового ряда); некрофар. Вак­цина против некробактериоза животных инактивированная.

Иммунитет после переболевания не наступает. Животные мо­гут повторно заразиться некробактериозом.

КОПЫТНАЯ ГНИЛЬ - инфекционная, хроническая болезнь овец, ягнят старше 3-4 мес (после отъема), характеризующаяся маце­рацией и воспалением кожи межкопытной щели и венчика, отслоени­ем и гнилостным распадом копытного рога подошвы, проявляющаяся хромотой с периодами обострения. Встречается и у телят.

Устойчивость. Возбудитель мало устойчив к факторам внеш­ней среды. В пастбищных условиях он сохраняется не более двух не­дель. Температура 90°С убивает его за 1 мин, 80°С - за 2 мин., рас­творы креолина, формалина, фенола, гидроокись натрия - в течение 15-20 мин. В пораженном копытном роге он сохраняется до трех лет. У переболевших животных возбудитель сохраняется в поражен­ных тканях до 3-4 лет.

Морфология. Возбудитель впервые выделил Беверидж (1941) - анаэробный микроорганизм Bacterioides nodosus (Fusiformis nodosus), относящийся к семейству Bacteroidaceace роду Bacteroides - представ­ляет собой, крупную (6-8 х 0,6-1 мкм), прямую или слегка изогнутую палочку, концы которой утолщены и окрашиваются интенсивно, что делает ее похожей на гантели. Спор и капсул не образует, неподвиж­на, по Граму не окрашивается. Часто возбудитель бывает окружен мелкими грамотрицательными палочками (феномен Бевериджа). При окраске метиленовой синью обнаруживаются зерна красного цвета вдоль палочки и на ее концах.

Материал для исследования. Для исследования в ветери­нарную лабораторию направляют:

• мазки-отпечатки из свежепораженной тканей;

• мазки из слизи и слизь, покрывающую кожу межкопытной щели;

• кусочки тканей, отобранные на границе здоровых и пора­женных участков;

• пораженные копыта от вынужденно убитых животных.

Отбор материала необходимо проводить от не леченых живот­ных.

Материал помещают в стерильную посуду или полиэтилено­вый пакет и с соблюдением мер, предотвращающих распространению инфекции, доставляют в термосе со льдом в ветлабораторию не позд­нее 24 ч после его отбора.

Культуральные свойства. В. nodosus - облигатный анаэроб. Он весьма требователен к составу питательных сред; его удается культивировать на полужидкой среде Китта-Тароцци и жидкой пита­тельной среде из экстракта головного мозга с добавлением 2-5 % триптического перевара порошка копытного рога (на этих средах микробы растут в виде тяжей, на дне пробирки образуют осадок; газо­образование отсутствует или слабое). Величина и форма колоний за­висят от состава плотных питательных сред: на лактоальбуминовом агаре вырастают плоские блестящие шероховатые колонии диамет­ром до 1 мм, вдавленные в среду; на тиаминцистеиновой среде - выпуклые блестящие колонии с ровными краями.

Лабораторная диагностика. Диагноз ставят с учетом лабора­торных исследований. Для бактериоскопии готовят мазки-отпечатки из свежепораженных участков, которые окрашивают по Граму и мик-роскопируют. Обнаружение в поле зрения 20 и более палочек В.nodosus позволяет поставить предварительный диагноз. Для получе­ния первичной культуры возбудителя рекомендуется использовать бульон Вейберга в модификации Коваленко с добавлением 2 % по­рошка рога (копытного) овец, 0,01 % цистеина.

Биопробу ставят на здоровых овцах. Из различных участков больных копытцев собирают свежепораженные ткани и слизь, кото­рые в нативном состоянии или в виде эмульсии 1:5-1:10 на стериль­ном физрастворе втирают подопытным овцам (ягнятам) в скарифици­рованную кожу межпальцевых щелей двух конечностей. Через 4-6 (в положительном случае) дней обнаруживают первые признаки заболевания (одновременное отторжение рогового и производящего слоев эпидермиса вместе с основной мембраной от основы кожи межпальцевой щели). Возбудитель не патогенен для лабораторных животных и куриных эмбрионов.

Иммунитет. Изучен недостаточно. В сыворотке кроен больных и вакцинированных животных проявляются агглютинины к О- и К- антигенам возбудителя, а также комплементсвязывающие антитела.

Для серодиагностики предложена РСК, чувствительность ко­торой составляет около 80 %.

Идентификацию возбудителя в патологическом материале проводят также непрямым методом иммунофлуоресценции, а в культуре только непрямым методом иммунофлуоресценции.

Биопрепараты. Ванны с 10 %-ными растворами медного ку­пороса, сульфата цинка, формалина (применяют в течение месяца); задают сульфат цинка внутрь - 0,75 г/гол; антибиотики пролонгиро­ванного действия: бицилин-3, дибиомицин и др. Для активной имму­низации применяют инакти вированные вакцины.