Ход выполнения работы:

Задание 1. Изучить морфологию микроорганизмов в предложенных вариантах накопительного субстрата.

Вариант 1. Накопительная культура картофельной палочки Bacillus subtilis, полученная следующим образом: очищенный картофель нарезают ломтиками, помещают в чашки Петри и прогревают 10 мин при температуре 100^оС в стерилизаторе (инактивируются все вегетативные клетки микроорганизмов), после чего помещают в термостат на 2-3 дня при температуре 25-30^оС. На картофеле прорастают споры и образуется крепкая морщинистая пленка, при микроскопировании которой видны подвижные палочки длиной до 4-5 мкм, часто соединенные в цепочки.

Вариант 2. Накопительная культура уксуснокислых бактерий, полученная следующим образом: в пробирку со стерильным молоком, подкисленным до рН 5,5-5,8, вносят петлей кефирную закваску, выдержанную 48 ч. при комнатной температуре. Получение биомассы выражается в свертывании молока и образовании желтого кольца на поверхности сгустка.

Вариант 3. Накопительная культура маслянокислых бактерий (род Clostridium), полученная следующим образом: в большую пробирку или колбу на 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водопроводной водой (расстояние до пробки 2-3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80^оС в течение 10 мин в водяной бане, после чего помещают в термостат при температуре 37^оС.Через 1-2 суток в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Для микроскопирования берут культуральную жидкость со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.

Задание 2. Изучить биохимические методы идентификации бактерий в предложенных вариантах накопительного субстрата:

а. Изучить способность к ферментации углеводов методом «пестрого ряда».

Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода, индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.

При определении способности микроорганизмов к ферментации углеводов в пронумерованный ряд пробирок с разным количеством лактозы засевают одинаковое количество накопительной культуры (1 микробиологическая петля). Результаты оценивают через 72 ч.

б. Изучить способность бактерий к расщеплению белков.

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализирующие расщепление белков. Наличие у культуры протеолитических ферментов из группы коллагеназ определяют при посеве уколом на среду КМАФАнМ. При положительном результате наблюдают ее разжижение в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и аминокислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты - аммиак, индол и сероводород - сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Пробирки со средой после засева культуры ставят в термостат на 37^оС на 72 ч. По истечении этого времени отмечают разжижение среды вокруг укола петлей.

в. Изучить способность микроорганизмов к образованию аммиака. Для определения способности к образованию NH₃ проводят посев на среду КМАФАнМ, и между ее поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Рекомендуется поместить лакмусовую бумажку в вариант засева по пункту б) для избежания дублирования засева.

г. Определить пектолитическую активность.

Исследуемые бактериальные культуры засевают «медальонами” на поверхность полноценной питательной агаризованной среды, содержащей ионы Са²⁺, с нанесенным на нее пектиновым гелем. После инкубирования в течение 72 ч при 37^оС продукцию пектолитических ферментов регистрируют по образованию лунок на поверхности геля.