Флуоресценция
Однофотонная флуоресценция.
При возбуждении биологических объектов ультрафиолетовым светом (_ 6 370 нм)
можно наблюдать флуоресценцию как белков, так и нуклеиновых кислот — это так
называемая автофлуоресценция (АФ) или собственная флуоресценция биологического материала. Квантовый выход флуоресценции всех составляющих нуклеиновых кислот имеет величину около 10−4–10−5, что соответствует временам жизни возбужденных состояний порядка пикосекунд. Автофлуоресценция белков определяется аминокислотами, фенилаланином, тирозином и триптофаном с максимумами поглощения соответственно на 257 нм, 275 нм и 280 нм и максимумами испускания между 280 нм (фенилаланин) и 350 нм (триптофан). В спектре излучения белков обычно доминирует триптофан. Флуоресценция коллагена и эластина возбуждается между 300 и 400 нм и демонстрирует широкие полосы испускания между 400 и 600 нм с максимумами около 400 нм, 430 нм и 460 нм. В частности, флуоресценция коллагена и эластина может использоваться для распознавания различных типов биотканей.
Восстановленная форма кофермента никотинамидадениндинуклеотида (НАД·H)
селективно возбуждается в диапазоне длин волн между 330 и 370 нм. Кофермент НАД·H сконцентрирован, в основном, в митохондриях, где он окисляется внутри дыхательной цепи, локализованной во внутренней митохондриальной мембране и поэтому его флуоресценция является индикатором ишемических или опухолевых тканей. Было показано, что флуоресценция свободного или связанного c белком НАД·H чувствительна к концентрации кислорода. Флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) с максимумами возбуждения около 380 нм и 450 нм также дают вклад в собственную флуоресценцию клетки.
Молекулы порфиринов, например протопорфирин, копропорфирин, уропорфирин
или гематопорфирин имеют отношение к биосинтезу гемоглобина, миоглобина и цитохромов. Аномалии синтеза гема, возникающие в случаях порфирии и некоторых других гемолитических заболеваний, могут вызывать значительное повышение уровня порфирина в биотканях. Многие бактерии, например Propionibacterium acnes, или бактерии зубного налета, такие как Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Prevotella nigrescens, накапливают значительные количества протопорфирина. Поэтому автофлуоресценция оказывается перспективным методом диагностики и мониторинга кожного акне (угревой сыпи), поражений ротовой полости и зубов.
В настоящее время для исследования анатомии и физиологии клеток можно применять разнообразные экзогенные флуоресцирующие красители. На человеке такие красители, как флуоресцеин и индоцианин зеленый, применяются для флуоресцентной ангиографии и определения объема крови. Недавно описаны новые флуоресцентные контрастные агенты для оптической визуализации опухолей in vivo на основе платформ векторной доставки красителя к опухолевым клеткам, такие как рецептор-нацеленные конъюгаты краситель–пептид и белки, флуоресцирующие в зеленой области. Исследованы флуоресцентные свойства таких красителей, как альбуминовый синий 633 и 670 в плазме и цельной крови.
Также исследованы экзогенные специфические флуоресцентные маркеры для
количественного трехмерного определения локализации опухолей in vivo. Спектры флуоресценции часто содержат подробную информацию о флуоресцирующих молекулах, их конформации, сайтах связывания и взаимодействии в клетках и тканях. Интенсивность флуоресценции можно измерять либо как функцию длины волны испускаемого света, либо как функцию длины волны возбуждения. Спектр испускания флуоресценции специфичен для каждого флуорофора и обычно используется во флуоресцентной диагностике.
Многофотонная флуоресценция.
Новое направление в лазерной спектроскопии и визуализации биологических объектов связано с многофотонной (двух и трехфотонной) флуоресцентной сканирующей микроскопией, которая позволяет отображать функциональные состояния объекта или, в сочетании с автокорреляционным анализом сигнала флуоресценции, определять внутриклеточную подвижность в малых объемах . Метод многофотонной флуориметрии использует как баллистические, так и рассеянные фотоны на длине волны излучения, приходящие точно из фокальной области возбуждающего пучка. Уникальными преимуществами многофотонной микроскопии является возможность исследования трехмерных распределений хромофоров, обычно возбуждаемых ультрафиолетовым излучением в сравнительно объемных образцах, а также возможность использования широкоапертурных фотоприемников. Например, для двухфотонной микроскопии излучение хромофоров (на длине волны 350 нм) возбуждается лазерным излучением, длина волны которого (700 нм) попадает в область высокой прозрачности биоткани. Возбуждающее излучение может достигать глубоко лежащих слоев и меньше повреждает биоткань. Излучение флуоресценции в этом случае
лежит в видимом диапазоне (> 400 нм) и сравнительно легко выходит из биоткани
и достигает приемника, который регистрирует только нужный сигнал от фокального объема без какого-либо постороннего фона. При этом для повышения отношения
сигнал/шум сигнал из фокального объема можно собирать по многим направлениям.
Скорость двухфотонного возбуждения пропорциональна среднему квадрату плотности фотонов. Эта квадратичная зависимость вытекает из требования, чтобы флуорофор одновременно поглощал два фотона в каждом акте возбуждения.
Лазерный свет в микроскопе с многофотонным возбуждением фокусируется объективом микроскопа в фокальный объем. Только в этом объеме интенсивность сфокусированного излучения достаточна для существенного возбуждения. Низкая плотность потока фотонов вне фокального объема приводит к пренебрежимо малому сигналу флуоресценции.
Способность микроскопа с многофотонным возбуждением оптически выделять тонкие слои обусловлена нелинейной зависимостью процесса возбуждения от интенсивности и сильной фокусирующей способностью объектива микроскопа. Большинство образцов сравнительно прозрачно в ближней инфракрасной области. Фокусировка объективом микроскопа приводит к многофотонному возбуждению поглощающих в ультрафиолетовом диапазоне флуорофоров в малом фокальном объеме. Сканирование фокального пятна в трех измерениях позволяет получить трехмерные изображения объекта в виде соответствующего распределения сигнала флуоресценции при многофотонном возбуждении. Таким образом, в микроскопе с многофотонным возбуждением неразрушающее оптическое секционирование (аналогичное гистологическим срезам) происходит в процессе возбуждения. Итак, исследования биотканей и клеток с помощью двухфотонной микроскопии характеризуются следующими типичными параметрами лазерных систем: длина волны от 700 до 960 нм, длительность импульса порядка 150 фс, частота повторения импульсов 76–80 МГц, средняя мощность менее 10 мВт. Такие параметры могут быть обеспечены при использовании лазера на красителе с синхронизацией мод и накачкой Nd:YAG-лазером или титан-сапфирового лазера с накачкой аргоновым лазером. Твердотельные лазеры с диодной накачкой также перспективны для задач двухфотонной микроскопии. Практически такие же параметры лазеров требуются для трехфотонной флуоресцентной микроскопии, которая обладает теми же преимуществами, что и двухфотонная, но гарантирует несколько более высокое пространственное разрешение и обеспечивает возможность возбуждать хромофоры с более короткими длинами волн поглощения.