1.6. Флуоресценция
1.6.1. Однофотонная флуоресценция.
Одним из фундаментальных явлений, возникающих при взаимодействии света с биологическими объектами, является их люминесценция — широкополосное свечение на более длинных волнах по сравнению с длиной волны возбуждения. Люминесценцию можно разделить на флуоресценцию, соответствующую разрешенному оптическому переходу со сравнительно большим квантовым выходом и малым (наносекунды) временем жизни, а также фосфоресценцию, соответствующую ≪запрещенному≫ переходу с низким квантовым выходом и большим временем распада порядка нескольких микро- или миллисекунд [249, 250].
Поглощение света связано с электронным переходом из основного состояния в возбужденное состояние молекулы вещества. В результате свет, проходящий через слой толщины d, ослабляется как [251]
I(_) = I0 exp(−μad) = I010−"_cabd, (1.41)
где I(_) — интенсивность прошедшего света, I0 — интенсивность падающего света,
"_ — молярный коэффициент экстинкции, а cab — концентрация поглощающих
молекул. В рассеивающих образцах коэффициенты поглощения μa и рассеяния μs
(опущенный в уравнении (1.41)) суммируются, обусловливая последующее ослабле-
ние проходящего света (см. уравнение (1.1)).
Флуоресценция возникает после поглощения света и связана с электронным переходом из возбужденного состояния молекулы в основное состояние. Ее интенсивность дается выражением [251]
IF(_) = I0[1 − 10−"_cabd]_F
4_
, (1.42)
где _F — квантовый выход флуоресценции, а — телесный угол, в котором ре-
гистрируется изотропное излучение флуоресценции (угловая апертура приемника).
В случае тонких образцов, например, клеточных монослоев или образцов биопсии
толщиной несколько микрометров, выражение (1.42) может быть представлено в виде
IF(_) = I0 ln 10"_cabd_F
4_
. (1.43)
Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации и квантовому выходу флуоресценции поглощающих молекул. В рассеивающих средах длина пробега рассеянных и нерассеянных фотонов внутри образца различны, и выражения (1.42) и (1.43) требуют модификации с учетом эффектов многократного рассеяния. Однако в практически однородных тонких образцах линейная связь между IF, cab и _F сохраняется.
Прямые линии — радиационные переходы, волнистые линии — безызлучательные переходы. Если не рассматривать зависимость энергии электронных состояний от координат ядер, то различные состояния молекулы можно проиллюстрировать с помощью диаграммы Яблонского, как показано на рис. 1.22, б. Возбуждение обычно происходит
из основного синглетного состояния S0 на различные вибронные уровни возбужденных синглетных электронных состояний Sn, откуда быстрые безызлучательные переходы (≪внутренняя конверсия≫) за времена порядка фемтосекунд переводят молекулу в наинизшее возбужденное синглетное состояние S1. Из состояния S1 могут осуществляться различные переходы: переход в основное состояние S0 с излучением
флуоресценции (включая его колебательные подуровни) со скоростью kF, внутренняя конверсия в основное состояние S0 (скорость kIC), интеркомбинационный переход из
синглетного в триплетное состояние T1 (скорость kISC) и безызлучательный перенос энергии на соседнюю молекулу (скорость kET). Все эти скорости складываются:
k = kF + kIC + kISC + kET = 1/_ , (1.44)
43 определяя время жизни _ возбужденного состояния S1. Отношение kF/k соответствует квантовому выходу флуоресценции _F.
Хотя оптическая спектроскопия позволяет напрямую регистрировать только излучательные переходы, тем не менее, из результатов измерения времени жизни флуоресценции можно определить скорости kIC или kET. Отметим, что радиационный переход T1 → S0 запрещен по спину, и проявляется лишь у небольшого числа отдельных молекул.
Дипольные моменты переходов имеют определенную ориентацию относительно молекулы. При возбуждении линейно поляризованным светом преимущественно возбуждаются те молекулы, у которых дипольные моменты переходов параллельны вектору электрического поля падающего света. Это селективное возбуждение определенным образом ориентированных молекул приводит к частичной поляризации
флуоресценции, которая описывается степенью поляризации [249]:
PF =
IFk − IF⊥
IFk + IF⊥
(1.45)
или анизотропией флуоресценции
rF =
IFk − IF⊥
IFk + 2IF⊥
, (1.46)
где IFk и IF⊥ — интенсивности компонент флуоресценции, поляризованных параллельно или перпендикулярно электрическому вектору возбуждающего поля соответственно. Обычно PF и rF зависят от интервала времени между возбуждением и регистрацией флуоресценции, поскольку за время жизни возбужденных состояний многие молекулы меняют свою ориентацию за счет вращения (≪вращательная диффузия≫). Из измерений анизотропии флуоресценции с временным разрешением можно определить постоянную времени вращательной диффузии, связанную с объемом молекулы VM и вязкостью окружающей среды _ соотношением
_r =
_VM
kBT
, (1.47)
где kB — постоянная Больцмана, а T — абсолютная температура. Постоянная време-
ни вращательной диффузии около 13 нс соотносится с молекулярным весом белков
около 50 000 Да [249], а около 300 пс — протопорфирину с диаметром агрегатов
порядка 1,6 нм [251].
При возбуждении биологических объектов ультрафиолетовым светом (_ 6 370 нм)
можно наблюдать флуоресценцию как белков, так и нуклеиновых кислот — это так
называемая автофлуоресценция (АФ) или собственная флуоресценция биологического материала. Квантовый выход флуоресценции всех составляющих нуклеиновых кислот имеет величину около 10−4–10−5, что соответствует временам жизни возбужденных состояний порядка пикосекунд. Автофлуоресценция белков определяется аминокислотами, фенилаланином, тирозином и триптофаном с максимумами поглощения соответственно на 257 нм, 275 нм и 280 нм и максимумами испускания между 280 нм (фенилаланин) и 350 нм (триптофан). В спектре излучения белков обычно доминирует триптофан. Флуоресценция коллагена и эластина возбуждается между 300 и 400 нм и демонстрирует широкие полосы испускания между 400 и 600 нм с максимумами около 400 нм, 430 нм и 460 нм. В частности, флуоресценция коллагена и эластина может использоваться для распознавания различных типов биотканей.
Восстановленная форма кофермента никотинамидадениндинуклеотида (НАД·H)
селективно возбуждается в диапазоне длин волн между 330 и 370 нм. Кофермент НАД·H сконцентрирован, в основном, в митохондриях, где он окисляется внутри дыхательной цепи, локализованной во внутренней митохондриальной мембране и поэтому его флуоресценция является индикатором ишемических или опухолевых тканей. Было показано, что флуоресценция свободного или связанного c белком НАД·H чувствительна к концентрации кислорода. Флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) с максимумами возбуждения около 380 нм и 450 нм также дают вклад в собственную флуоресценцию клетки.
Молекулы порфиринов, например протопорфирин, копропорфирин, уропорфирин
или гематопорфирин имеют отношение к биосинтезу гемоглобина, миоглобина и цитохромов. Аномалии синтеза гема, возникающие в случаях порфирии и некоторых других гемолитических заболеваний, могут вызывать значительное повышение уровня порфирина в биотканях. Многие бактерии, например Propionibacterium acnes, или бактерии зубного налета, такие как Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Prevotella nigrescens, накапливают значительные количества протопорфирина. Поэтому автофлуоресценция оказывается перспективным методом диагностики и мониторинга кожного акне (угревой сыпи), поражений ротовой полости и зубов.
В настоящее время для исследования анатомии и физиологии клеток можно применять разнообразные экзогенные флуоресцирующие красители. На человеке такие красители, как флуоресцеин и индоцианин зеленый, применяются для флуоресцентной ангиографии и определения объема крови. Недавно описаны новые флуоресцентные контрастные агенты для оптической визуализации опухолей in vivo на основе платформ векторной доставки красителя к опухолевым клеткам, такие как рецептор-нацеленные конъюгаты краситель–пептид и белки, флуоресцирующие в зеленой области. Исследованы флуоресцентные свойства таких красителей, как альбуминовый синий 633 и 670 в плазме и цельной крови.
Также исследованы экзогенные специфические флуоресцентные маркеры для
количественного трехмерного определения локализации опухолей in vivo. Спектры флуоресценции часто содержат подробную информацию о флуоресцирующих молекулах, их конформации, сайтах связывания и взаимодействии в клетках и тканях. Интенсивность флуоресценции можно измерять либо как функцию длины волны испускаемого света, либо как функцию длины волны возбуждения. Спектр испускания флуоресценции специфичен для каждого флуорофора и обычно используется во флуоресцентной диагностике.
1.6.2. Многофотонная флуоресценция.
Новое направление в лазерной спектроскопии и визуализации биологических объектов связано с многофотонной (двух и трехфотонной) флуоресцентной сканирующей микроскопией, которая позволяет отображать функциональные состояния объекта или, в сочетании с автокорреляционным анализом сигнала флуоресценции, определять внутриклеточную подвижность в малых объемах [15, 20, 260–269]. Метод многофотонной флуориметрии использует как баллистические, так и рассеянные фотоны на длине волны излучения, приходящие точно из фокальной области возбуждающего пучка (см. рис. 1.23, б) [269]. Уникальными преимуществами многофотонной микроскопии является возможность исследования трехмерных распределений хромофоров, обычно возбуждаемых ультрафиолетовым излучением в сравнительно объемных образцах, а также возможность использования широкоапертурных фотоприемников. Например, для двухфотонной микроскопии излучение хромофоров (на длине волны 350 нм) возбуждается лазерным излучением, длина волны которого (700 нм) попадает в область высокой прозрачности биоткани. Возбуждающее излучение может достигать глубоко лежащих слоев и меньше повреждает биоткань. Излучение флуоресценции в этом случае
лежит в видимом диапазоне (> 400 нм) и сравнительно легко выходит из биоткани
и достигает приемника, который регистрирует только нужный сигнал от фокального объема без какого-либо постороннего фона. При этом для повышения отношения
сигнал/шум сигнал из фокального объема можно собирать по многим направлениям. Пример, приведенный на рис. 1.23, б, соответствует ситуации, характерной при исследовании биотканей, когда ИК-излучение лазера на длине волны 960 нм, хорошо проникающее в ткань, преобразуется в фокальной области лазерного пучка во вторую гармонику 480 нм, которая уже возбуждает излучение флуоресценции соответствующего хромофора в локальной области фокального пятна лазера.
Рис. 1.23. Многофотонная флуоресценция: сравнение однофотонной флуоресценции (а) (яркий конус свечения с перетяжкой примерно в центре кюветы) при возбуждении излучением с длиной волны 488 нм с двухфотонной (б) (светящаяся точка в центре кюветы, отмеченная белой стрелкой) при возбуждении ИК-излучением с длиной волны 960 нм [269]. Схема переходов показывает процессы поглощения и флуоресценции для молекулы: однофотонноепоглощение (в), двухфотонное поглощение (г), трехфотонное поглощение (д). Сплошными и штриховыми горизонтальными линиями изображены, соответственно, реальные и виртуальные молекулярные энергетические состояния; сплошные вертикальные стрелки — поглощение фотона, волнистые стрелки — флуоресценция
Скорость двухфотонного возбуждения пропорциональна среднему квадрату плот-
ности фотонов. Эта квадратичная зависимость вытекает из требования, чтобы флу-
орофор одновременно поглощал два фотона в каждом акте возбуждения. Процессы
многофотонного поглощения показаны на рис. 1.23, в, г, д. Чтобы убедиться в мно-
гофотонном характере возбуждения, нужно измерить интенсивность флуоресценции
как функцию интенсивности возбуждающего света. Двухфотонный процесс возбуж-
дения характеризуется угловым коэффициентом 2 на графике, по осям которого
отложены логарифмы измеренных интенсивностей, трехфотонное возбуждение ха-
рактеризуется наклоном 3 и т. д.
Скорость двухфотонного возбуждения можно выразить аналитически [264]:
n2f ≈
P2
0 _f
_pf2
p
_
_(NA)2
hc_
_2
, (1.48)
где _p — длительность импульса, fp — частота повторения импульсов, P0 — средняя
падающая мощность, _f — сечение поглощения фотона, h — постоянная Планка,
c — скорость света, NA — числовая апертура фокусирующей линзы, а _ — длина
волны. Эта скорость выражается как число фотонов, поглощенных флуорофором
за импульс, и является функцией длительности импульса, частоты повторения импульсов, сечения поглощения фотона и числовой апертуры объектива микроскопа, фокусирующего свет. Вывод этого уравнения предполагает пренебрежимо малое насыщение флуорофора и справедливость параксиального приближения. Лазерный свет в микроскопе с многофотонным возбуждением фокусируется объективом микроскопа в фокальный объем. Только в этом объеме интенсивность сфокусированного излучения достаточна для существенного возбуждения. Низкая плотность потока фотонов вне фокального объема приводит к пренебрежимо малому сигналу флуоресценции. Способность микроскопа с многофотонным возбуждением оптически выделять тонкие слои обусловлена нелинейной зависимостью процесса возбуждения от интенсивности и сильной фокусирующей способностью объектива микроскопа. Большинство образцов сравнительно прозрачно в ближней инфракрасной области. Фокусировка объективом микроскопа приводит к многофотонному возбуждению поглощающих в ультрафиолетовом диапазоне флуорофоров в малом фокальном объеме. Сканирование фокального пятна в трех измерениях позволяет получить трехмерные изображения объекта в виде соответствующего распределения сигнала флуоресценции при многофотонном возбуждении. Таким образом, в микроскопе с многофотонным возбуждением неразрушающее оптическое секционирование (аналогичное гистологическим срезам) происходит в процессе возбуждения. Итак, исследования биотканей и клеток с помощью двухфотонной микроскопии характеризуются следующими типичными параметрами лазерных систем: длина волны от 700 до 960 нм, длительность импульса порядка 150 фс, частота повторения импульсов 76–80 МГц, средняя мощность менее 10 мВт. Такие параметры могут быть обеспечены при использовании лазера на красителе с синхронизацией мод и накачкой Nd:YAG-лазером или титан-сапфирового лазера с накачкой аргоновым лазером. Твердотельные лазеры с диодной накачкой также перспективны для задач двухфотонной микроскопии [260]. Практически такие же параметры лазеров требуются для трехфотонной флуоресцентной микроскопии, которая обладает теми же преимуществами, что и двухфотонная, но гарантирует несколько более высокое пространственное разрешение и обеспечивает возможность возбуждать хромофоры с более короткими длинами волн поглощения [262].