Министерство здравоохранения Российской Федерации гоу впо Оренбургский государственный медицинский университет Кафедра микробиологии, иммунологии, вирусологии

МОДУЛЬ КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

(рабочая тетрадь для студентов)

Оренбург, 2015

1

Модуль Клиническая микробиология ЗАНЯТИЕМ

Тема: «Оппортунистические инфекции. Условно-патогенные бактерии - возбудите­ли эндогенных заболеваний. Внутрибольничные инфекции».

ЦЕЛЬ:

1. Изучить роль отдельных групп условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) в патологии человека и в развитии внутрибольничных инфекций. Актуальность госпиталь­ных инфекций для стационаров разного профиля.

2. Овладеть основными методами лабораторной диагностики инфекций мочевых

путей.

3. Овладеть методами идентификации госпитальных штаммов.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Клиническая микробиология изучает болезни микробной этиологии в неинфекци онной клинике: оппортунистические инфекции, внутрибольничные инфекции, дисбакте

риоз.

Оппортунистические инфекции вызывают УПМ в ослабленном организме человека.

К ним относятся бактерии, грибы, простейшие. По многим признакам близки к

УПМ некоторые виды вирусов (а-герпесвирусы типов 1 и 2, Р-герпесвирус, паповавирусы,

отдельные варианты аденовирусов, вирусов Коксаки и ECHO). УПМ вступают с организмом человека в одних случаях в отношения симбиоза, комменсализма и/или нейтрализма,

в других — в конкурентные отношения, нередко приводящие к развитию заболевания.

Поэтому они получили название «условно-патогенные микробы», т.е., обладая низкой

степенью патогенности для человека, они проявляют свои патогенные свойства только при определенных условиях, например при снижении иммунного статуса организма. Грань между патогенными микробами и УПМ весьма относительна. Поскольку УПМ в

литературе часто называют «микробами-оппортунистами» (от англ, totakeopportunity), вызываемые ими заболевания получили название оппортунистических инфекций. Оппортунистические инфекции могут вызываться более чем сотней видов УПМ. Чаще всего в их этиологии играют роль представители следующих родов:Staphylococcus, Streptococcus, Peptostreotococcus, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobachter, Serratia, Proteus, Haf- nia, Providencia, Pseudomonas, Haemophilus, Branhamella.Acinetobachter, Moraxella, Alcali- genes, Flavobacterium, Vibrio, Propionibacterium,Bacteroides, Fusobacterium, Bacillus, Myco- bacterium, Eikenella,Mycoplasma, Actinomyces, Candida, Cryvtococcus, Pneumocysta.

Факторы патогенности: адгезины, токсины, ферменты защиты и агрессии, факто­

ры персистенции и др.

Основные клинические формы инфекции: гнойно-воспалительные и гнойно-

септические заболевания различных органов и тканей, раневая и ожоговая инфекции, ост­рые кишечные инфекции.

Представители нормальной микрофлоры могут перемещаться в другие биотопы ор­ганизма (транслокация, миграция), что приводит к различным поражениям. Например, эпидермальный стафилококк с кожи колонизирует внутривенные катетеры; кишечная па­лочка из кишечника попадает в мочевую систему (циститы и др.); псевдомонады из носа мигрируют в среднее ухо.

Источником инфекции чаше всего является больной человек, — особенно со стер­той формой заболевания, или носитель. Наибольшую опасность в эпидемиологическом плане представляет медперсонал больничных учреждений, который может быть носите-

лем госпитальных штаммов УПМ, например стафилококков. Источником инфекции могут служить животные, например больные маститом коровы при стафилококковых токсико- инфекциях и энтероколитах. Иногда источником инфекции служат объекты больничной среды, обильно обсемененные свободноживущими видами УПМ, например псевдомона­дами, ацинетобактериями (сапронозы). Таким образом, оппортунистические инфекции в большинстве случаев представляют собой антропонозы, редко — зоо- антропонозы, ино­гда — сапронозы.

Лабораторная диагностика (рис.1)

Э кспресс-мегоды

Рис. 1 Схема лабораторной диагностики болезней микробной этиологии в неинфекционной кли- нике

Важным условием эффективности бактериологического исследования является правильное взятие исследуемого материала. Необходимо учитывать следующее:

а) выбор биологического материала для исследования определяется локализацией предполагаемого возбудителя на данном этапе болезни. В случае отсутствия или неопре­деленности локальных очагов исследуют кровь. Брать материал следует непосредственно из очага инфекции или исследовать соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

б) брать материал рекомендуется до начала антибактериальной терапии или через определенный промежуток времени после введения препарата, необходимого для его вы­ведения из организма (от 8ч до 3 сут. в зависимости от препарата и предполагаемого воз­будителя).

в) брать материал нужно во время наибольшего содержания в нем возбудителей забо­левания (например, кровь для выделения гемокультуры при повышении температуры в начале периода озноба и т.д.).

г) следует соблюдать правила асептики (во избежание контаминации пробы микро­флорой окружающей среды и представителями нормальной микрофлоры тела);

д) отбор материала для выделения аэробов и факультативных анаэробов производят стерильными ватными тампонами (отделяемое из раны, мазки со слизистых оболочек, из глаза, носа, зева, цервикального канала, влагалища, анального отверстия), специальными приспособлениями (петлями, трубками, щетками и др.), шприцем (кровь, гной, экссуда­ты), непосредственно в стерильную посуду (моча, мокрота, фекалии);

е) материал для выделения строгих анаэробов получают из патологического очага пу­тем пункции шприцем, из которого предварительно удален воздух, при исследовании ку­

3

сочков ткани их берут из глубины очага. При необходимости использовать тампоны, их нужно сразу же после взятия материала погружать в транспортную среду;

ж) количество материала должно быть достаточным для исследования и его повторе­ния в случае необходимости; при низкой концентрации возбудителя стараются взять большое количество материала;

з) транспортировку нативного клинического образца материала в лабораторию следу­ет производить в максимально короткие сроки, так как при длительном его хранении про­исходит гибель многих видов возбудителей, начинают размножаться менее требователь­ные и быстро растущие виды, что приводит к нарушению количественного соотношения видов микробов. Если материал нельзя немедленно транспортировать в лабораторию, сле­дует использовать транспортные среды или поместить материал в условия бытового холо­дильника (приемлемо не для всех возбудителей). Материал для микробиологического ис­следования транспортируют в специальных биксах, пеналах и т.п.;

и) клинические образцы для культивирования анаэробов следует транспортировать в лабораторию, максимально защищая их от воздействия кислорода воздуха (используют специальные герметично закрытые флаконы, заполненные бескислородной газовой сме­сью или специальной транспортной средой, в которую вносят исследуемый материал уко­лом иглы через резиновую пробку флакона; материал можно транспортировать прямо в шприце, на кончик которого надета стерильная резиновая пробка);

к) к клиническому образцу, направляемому в лабораторию, прилагают сопроводи­тельный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микро­биологического исследования (характер материала, Ф.И.О. больного, название учрежде­ния или отделения, номер истории болезни, предполагаемый диагноз заболевания, пред­шествующая антимикробная терапия, дата и время взятия материала, подпись врача, направляющего материал для исследования).

Особенности взятия исследуемого материала при разной локализации гнойно­воспалительного процесса:

а) Бактериемия и сепсис. Кровь для посева берут из вены: 5-10 мл крови сеют в 50-100 мл жидкой питательной среды (1% сахарный бульон, двухфазная среда, СКС и др.).

б) Инфекции мочевыводящих путей. После тщательного туалета наружных половых органов собирают среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 3-5 мл. Взятие мочи с помощью катетера проводят только, если больной не способен мочиться или для дифференциации локализации воспалительного процесса в почках и мочевом пу­зыре. Посев мочи делают по Голду (метод секторных посевов) для определения степени бактериурии.

в) Инфекции нижних дыхательных путей (бронхиты, пневмонии). Исследуют утрен­нюю порцию мокроты. Перед сбором мокроты больной должен прополоскать рот кипяче­ной водой, почистить зубы. Мокроту собирают в плевательницу, чашку Петри. Наиболее информативно исследование мокроты, взятой при бронхоскопии.

г) Инфекции верхних дыхательных путей. Отделяемое носа берут стерильным ватным тампоном из глубины полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднегло­точным тампоном, из зева (с миндалин) - увлажненным ватным тампоном, не касаясь корня языка.

д) Менингит. Взятие проб ликвора путем прокола толстой иглой спинномозговой оболочки в поясничной области проводится при строжайшей асептике. Первые капли ликвора, поступающие через иглу (до 1мл) собирают в пробирку для цитоскопических исследований. Для посева используют следующую порцию ликвора - 2-5 мл. При подо­зрении на туберкулезную либо грибковую этиологию менингита следует брать не менее10мл ликвора.

е) Инфекции женских половых органов. Отделяемое влагалища берут стерильным ватным тампоном из заднего свода. Отделяемое канала шейки матки берут тонким ватным тампоном после обработки зева шейки матки. При поражении внутренних гениталий

4

информативным исследуемым материалом может быть менструальное содержимое, взятое с соблюдением правил асептики.

ж) Раневая инфекция. Раневое отделяемое берут стерильным ватным тампоном из глубины раны. При наличии в ране дренажа отделяемое берут стерильным шприцем.

з) Инфекции глаз и ушей. Отделяемое глаз забирает врач-окулист стерильным ватным микротампоном с внутренней поверхности нижнего века к внутреннему углу глазной ще­ли. При гнойном среднем отите гной из барабанной полости берет врач-отоларинголог с помощью тампона через отверстие в барабанной перепонке или путем ее пункции.

и) Кишечные инфекции и пищевые отравления. Материалом для исследования служат испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты и сырье, с которыми связывают развитие болезни. Исследуемый материал в количестве 1 г (1 мл) суспендируют в 10 мл 0,5% раствора хлорида натрия, встряхивают, отстаивают 15 мин и недостаточную жидкость засевают на питательные среды.

При идентификации условно-патогенного микроорганизма как возбудителя исполь­зуются следующие микробиологические критерии: показатель микробной обсемененности исследуемого материала (> 1x10⁵КОЕ/мл или КОЕ/г), наличие факторов вирулентности и персистенции, показатели межмикробного взаимодействия в биотопе (часто болезнь вы­зывается ассоциацией возбудителей), критерии миграции (транслокации) патогена; нарастание титра антител к аутоштамму (серологический метод).

Терапия. Антибиотики, бактериофаги, пробиотики, специфические сыворотки (иммуноглобулины).

Профилактика. Повышение естественной резистентности организма, устранение иммунодефицита: применение иммуномодуляторов, адаптогенов.

Внутрибольничные инфекции (ВБИ)

Внутрибольничные (госпитальные, нозокомиальные, ятрогенные) инфекции

поражают больного в результате его пребывания в стационаре.

Этиология. Возбудители - патогенные и условно-патогенные виды микроорганиз­мов. Патогенные виды:S.aureus,S.pyogenes,S.flexneri, вирус гриппа, вирус гепатита В и др. Условно-патогенные виды могут вызывать как экзогенные, так и эндогенные (оппор­тунистические) ВБИ.

Часто возбудителями внутрибольничной инфекции являются госпитальные штам­мы - эковары, хорошо адаптированные и персистирующие в определенной больничной среде. Госпитальные штаммы характеризуются следующими свойствами: множественная резистентность к антибактериальным препаратам, устойчивость к антисептикам и дезин­фектантам, высокий полиморфизм популяций, широкий и вариабельный набор факторов патогенности, выраженная способность к колонизации тела человека.

Патогенез. Формы патологии: гнойно-воспалительные заболевания, гнойно­септические формы инфекции, послеоперационные осложнения, раневые и ожоговые ин­фекции, кишечные инфекции и др. Условия развития внутрибольничных инфекций: нарушение правел асептики; широкое внедрение методов диагностики, связанных с нару­шением целостности кожи и слизистых оболочек; расширение спектра и тяжести опера­тивных вмешательств; использование иммунодепрессантов; формирование и циркуляция госпитальных штаммов. ВБИ, наслаиваясь на основное заболевание, утяжеляют его тече­ние, затрудняют диагностику и лечение.

Лабораторная диагностика

Критерий идентификации госпитального штамма - выделение одного и того же эковара от больных и источников их заражения.

Эпидемиология. Источники инфекции: медицинский персонал (бактерионосите­ли), больные, объекты внешней среды (инструменты, приборы и др.). Пути передачи: ар- тифициальный (контактный, парентеральный), пищевой, аэрогенный.

5

Профилактика. Выявление бактерионосителей среди больных и медицинского персонала. Исследование объектов внешней среды на контаминацию госпитальными штаммами. Выполнение мероприятий асептики.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:

1. Понятия «постоянная (аутохтонная) и транзиторная (аллохтонная) микрофлора», «условно-патогенный микроорганизм», «оппортунистическая инфекция». Факторы, способствующие развитию оппортунистической инфекции.

2. Основные виды УПБ, возбудителей оппортунистических инфекций (энтеробактерии, стафилококки и стрептококки). Анаэробные УПБ (клостридии и неспорообразующие анаэробы).

3. Факторы патогенности УПБ (факторы колонизации, вирулентности и персистенции). Механизмы персистенции бактерий.

4. Этиология, патогенез и особенности клинической картины эндогенных болезней.

5. Лабораторная диагностика эндогенной инфекции.

6. Особенности эпидемиологии ВБИ.

7. Характеристика госпитальных штаммов и их критерии идентификации.

8. Основные направления профилактики и лечения оппортунистических и госпиталь­ных инфекций.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:

1. Изучить таблицу: Механизмы и пути передачи инфекционных заболеваний.

2. Выполнить практические работы:

• Лабораторная диагностика инфекций мочевых путей

• Идентификация госпитальных штаммов стафилококков.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

Работа 1

Цель: Овладеть навыком бактериологической диагностики инфекций мочевых пу­тей.

Задача. В бактериологическую лабораторию поступили 3 образца мочи от пациен­тов с предварительным диагнозом «Инфекция мочевых путей». Проведите лабораторное исследование для подтверждения возможного диагноза ИМП и оцените его результат.

Методика (метод секторных посевов Gould)

1. Бактериологической петлей диаметром 3 мм произвести посев (30-40 штрихов) исследуемого материала (мочи) на 1 -й сектор чашек Петри с питательными средами (Эндо и 5% кровяным агаром). После этого петлю прожечь и произвести 4 штриховых посева из 1-го сектора по 2-й, аналогичным образом из 2-го сектора в 3-й, и из 3-го в 4-й (см. рису­нок), прожигая петлю после пересева с каждого сектора. Чашки инкубировать в термоста­те при 37°С в течение 18-24 часов.

2. Подсчитать число колоний, выросших в разных секторах. Количество бактерий в 1мл жидкости определить по таблице.

Количество бактерий, выросших на секторе						Количество
1-м	2-м	3-м	4-м		бактерий в 1 мл жидкости
1-6	Нет роста	Нет роста	Нет роста		1 000
8-20	» »	»»	» »		1 000
21-30	» »	» »	» »		5 000
31-60	» »	»»	» »		10 000
70-80	» »	»»	» »		50 000
100-150 Очень большое	5-10	»»	» »		100 000
количество	20-30	»»	» »		'500 000
То же	40-60	»»	» »		1 000 000
» »	100-140 Очень большое	10-20	» »		5 000 000
»»	количество	30-40			10 000 000
»»	То же	60-80	Единичные		50 000 000
»»	»»	80-140	От единичных ДО 25		100 000 000

*Таблица взята из статьи Ю. М. Фельдман с соавт. "Количественное определение бакте­рий в клинических материалах" //Лаб. дело.- 1984.- №10,- С. 616-619. ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: I этап. Исследуемый материал	Метод диагно­стики	Пита-­ тельная среда	Характеристика ко­лоний	Число колоний и их типов по секторам					Степень бактери- урии, КОЕ/мл
				1	2	3	4
		Эндо	Лак+ (А)
			Лак- (Б)
		Кровя­ной агар	Гем+ (В)

7

Гем- (Г)

II этап. Идентификация чистой культуры Штамм	Морфология (рис.)	Биохимические свойства (ЭНТЕРО-тест или СТАФИ-тест)													АЛА, мкг/м л		Вид микроорга­ низма
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
А
Б
В
Г

Вывод:

1. Есть ли бактериурия у данного пациента?

_____________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. На основании каких критериев подтверждается этиологическая значимость выделенно­го микроорганизма?

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Работа 2. Идентификация госпитальных штаммов стафилококков.

Цель: Определить диагностические критерии госпитальных штаммов для постановки ди­агноза ВБИ.

Задача.

В реанимационном отделении у больного, находящегося на аппарате искусствен­ной вентиляции легких, возникла флегмона нижней челюсти. Из очага гнойно­воспалительного заболевания от больного (штамм № 1) и с контура дыхательной аппара­туры (штамм № 2) были выделены бактерииS.aureus.

Установите госпитальную принадлежность штаммов стафилококков. Докажите, что флегмона у больного является случаем ВБИ.

8

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: Исследуе­мый штамм	Устойчивость к АБ	Устойчивость к дезинфектантам	Устойчивость кУФЛ	АЛА	Фаготип
Штамм №1
Штамм №2

Анаэробные микроорганизмы					Факультативно анаэробные микроорганизмы
Грамположительные		Грамотрицательные		Грамположительные				Грамотрицательные
Палочки	Кокки	Палочки	Кокки	Палочки		Кокки	Палочки		Кокки

10