БХ

Энзимодиагностика - методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности энзимов (ферментов) в биологических жидкостях. В особую группу выделяются иммуноферментные диагностические методы, состоящие в применении антител, химически связанных с каким-либо ферментом, для определения в жидкостях веществ, образующих с данными антителами комплексы антиген — антитело. Использование энзимных тестов является важным критерием в распознавании врожденных энзимопатий, характеризующихся специфическими нарушениями обмена веществ и жизнедеятельности в связи с отсутствием или недостатком того или иного фермента. Ферменты представляют собой специфические высокомолекулярные белковые молекулы, являющиеся биологическими катализаторами, т.е. ускоряющими химические реакции, протекающие в живых организмах. Проникновение ферментов из клеток во внеклеточную жидкость, а затем в кровь, в мочу или другие биологические жидкости служит чрезвычайно чувствительным показателем повреждения плазматических мембран или повышения их проницаемости (например, вследствие гипоксии, гипогликемии, воздействия некоторых фармакологических веществ, инфекционных агентов, токсинов). Это обстоятельство лежит в основе диагностики повреждения клеток органов и тканей по феномену сопровождающей его гиперферментемии, причем выявляемое повышение активности фермента или его изоформы может иметь разную степень специфичности для поврежденного органа. Распределение отдельных изоферментов в тканях более специфично для определенной ткани, чем суммарная ферментативная активность, поэтому исследование некоторых изоферментов приобрело важное значение для ранней диагностики поражения отдельных органов и тканей. Так, например широко используется определение активности в крови изоферментов креатинфосфокиназы для диагностики острого инфаркта миокарда,лактатдегидрогеназы — для диагностики поражений печени и сердца, кислой фосфатазы — ираспознавании рака предстательной железы Диагностическая ценность энзимных тестов достаточно высока; она зависит как от специфичности данного вида гиперферментемии для определенных болезней, так и от степени чувствительности теста, т.е. кратности возрастания активности фермента при данном заболевании относительно нормальных значений. Однако большое значение имеет время постановки теста, т.к. появление и продолжительность гиперферментемии после повреждения органа различны и определяются соотношением скорости поступления фермента в кровоток и скорости его инактивации. При отдельных заболеваниях надежность их диагностики может быть повышена исследованием не одного, а нескольких изоферментов. Так, например, достоверность диагноза острого инфаркта миокарда возрастает, если в определенные сроки отмечено повышение активности креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы и аспарагиновой аминотрансферазы. Степень выявляемой гиперферментемии объективно отражает тяжесть и распространенность повреждения органа, что позволяет прогнозировать течение заболевания.

145. Свертывающая система крови. Этапы образования фибринового сгустка. Внутренний и внешний пути свертывания и их компоненты.

При повреждении кровеносного сосуда инициируется каскад реакций, в результате которого образуется сгусток крови - тромб, предотвращающий кровотечение. Основную роль в свёртывании (коагуляции) крови играют тромбоциты и ряд белков плазмы крови. В остановке кровотечения различают 3 этапа. На первом этапе происходит сокращение кровеносного сосуда. Затем к месту повреждения прикрепляются тромбоциты, которые, наслаиваясь друг

на друга, образуют тромбоцитарную пробку (белый тромб). Белый тромб является непрочным и может закупорить только небольшой кровеносный сосуд. На третьем этапе растворимый белок плазмы крови фибриноген превращается в нерастворимый белок фибрин, который откладывается между тромбоцитами, и формируется прочный фибриновый тромб. Такой тромб содержит эритроциты и поэтому называется красным тромбом. Образованию фибринового тромба предшествует каскад протеолитических реакций, приводящий к активации фермента тромбина, который и превращает фибриноген в фибрин. Все белки, участвующие в свёртывании крови, называют факторами свёртывания. Они синтезируются в основном в печени и клетках крови в виде неактивных предшественников, обозначаются римскими цифрами, но имеют и тривиальные названия Большинство этих белков активируется в каскаде ферментативных реакций свёртывания крови. Активные формы этих белков обозначают такими же римскими цифрами, но с добавлением буквы "а".

Основные функции и содержание в плазме крови факторов свёртывания крови

146. Принципы образования и последовательность фукционирования ферментных комплексов прокоагулянтного пути. Роль витамина К в свертывании крови.

Для остановки кровотечения из капилляров и сосудов необходимо быстрое образование прочного тромба, препятствующего потере крови. Это достигается каскадом ферментативных реакций с механизмами усиления на многих этапах. Прокоагулянтный путь занимает центральное место в свёртывании крови. В циркулирующей крови содержатся проферменты протеолитических ферментов: фактор II (протромбин), фактор VII (проконвертин), фактор IX (Кристмаса), фактор X (Стюарта). Находящиеся в крови факторы Va (акцелерин) и VIIIa (антигемофильный фактор), а также мембранный белок - тканевый фактор (ТФ, фактор III) являются белками-активаторами этих ферментов. При повреждении сосуда "включается" каскадный механизм активации ферментов с последовательным образованием трёх связанных с фосфолипидами клеточной мембраны ферментных комплексов. Каждый комплекс состоит из протеолитического фермента, белка-активатора и ионов Са2+: VIIa-TO-Ca2+, IXa-VIIIa-Са2+ (теназа), Xa-Va- Са2+ (протромбиназа). Комплекс Xa-Va-Са2+ (протромбиназный комплекс) активирует протромбин (фактор II). Каскад ферментативных реакций завершается образованием мономеров фибрина и последующим формированием тромба. В активации ферментов каскада выделяют три основных механизма: частичный протеолиз, взаимодействие с белкамиактиваторами и взаимодействие с модифицированными клеточными мембранами.

Активация частичным протеолизом. Все ферменты прокоагулянтного пути являются сериновыми протеазами, синтезируются в печени в виде неактивных проферментов и в такой форме циркулируют в крови. В процессе реализации тромбогенного сигнала проферменты (факторы VII, IX, X и II) частичным протеолизом превращаются в активные ферменты.

Тромбин фактор IIа) - гликопротеин с молекулярной массой 39 кД. Он образуется в крови из неактивного предшественника протромбина. Протромбин синтезируется в печени, имеет молекулярную массу 70 кД и содержит остатки. -карбоксиглутаминовой кислоты. Концентрация этого белка в крови в норме составляет 0,1 г/л. Он фиксируется на мембранном ферментном комплексе Xa-Va-Са2+, взаимодействуя, с одной стороны, остатками у- карбоксиглутамата с Са2+, а с другой - непосредственно с белком-активатором Va. Таким образом, создаются наилучшие стерические условия для протекания ферментативной реакции. Фактор Ха гидролизует две пептидные связи в молекуле протромбина. В результате этого образуется молекула тромбина, состоящая из двух цепей - лёгкой и тяжёлой, связанных между собой одной дисульфидной связью Молекула тромбина не содержит остатков γ- карбоксиглутамата и освобождается из протромбиназного комплекса. Тромбин частичным протеолизом превращает фибриноген в фибрин и активирует факторы VII, VIII, V, XIII. Тромбин выполняет ряд важных физиологических функций: является ферментом прокоагулянтного и контактного путей свёртывания крови, инициирует реакции антикоагулянтной фазы, вызывает агрегацию тромбоцитов и оказывает митогенное действие, участвуя в пролиферации и репарации клеток. Частичным протеолизом активируются также факторы V и VIII, превращаясь, соответственно, в факторы Va и VIIIa. В результате активации этих факторов изменяется их конформация и повышается сродство к фосфолипидам мембран и ферментам, которые они активируют.

Взаимодействие белков-активаторов с протеолитическими ферментами. Тканевый фактор, фактор Va и фактор VIIIa

имеют центры связывания с фосфолипидами мембран и ферментами VIIa, IXa и Ха, соответственно. При связывании с белками-активаторами в результате конформационных изменений активность этих ферментов повышается.

Тканевый фактор фактор III) представляет собой комплекс, состоящий из белка и фосфатидилсерина. Белковая часть тканевого фактора (апопротеин III) экспонирована на поверхности многих клеток (мозга, лёгких, печени, селезёнки и др.) и связана с фосфатидилсерином плазматических мембран. Однако появление апопротеина III на поверхности клеток, соприкасающихся с кровью (эвдотелиальных и моноцитов), происходит только при определённых условиях: при повреждении сосуда и/или нарушении нормальной асимметрии их плазматических мембран. Тканевый фактор в протеолитической активации не нуждается.

Фактор V и фактор VIII - доменные белки, циркулирующие в крови. Фактор V синтезируется в печени, а фактор VIII - эндотелиальными клетками. Оба фактора активируются частичным протеолизом под действием тромбина. Фактор VIII

вплазме крови находится в комплексе с белком - фактором тромбоцитов фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда

вэтом комплексе стабилизирует фактор VIII, препятствуя его разрушению прогеолитическим ферментом антикоагулянтной фазы фактором Са.

Взаимодействие ферментных комплексов с клеточными мембранами происходит с участием ионов Са2+. Все проферменты прокоагулянтного пути (II, VII, IX, X) содержат остатки у-кар-боксиглутаминовой кислоты, образующиеся в результате посттрансляционой модификации этих белков в ЭР гепатоцитов. Остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты в факторах VIIa, IXa и Ха обеспечивают взаимодействие этих ферментов посредством Са2+ с отрицательно заряженными фосфолипидами клеточных мембран. В отсутствие ионов Са2+ кровь не свёртывается.

Роль витамина К в карбоксилировании остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути свёртывания крови. Карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути катализирует карбоксилаза, коферментом которой служит восстановленная форма витамина К (нафтохинона) - дигидрохинон витамина К. Поступивший в организм витамин К (нафтохинон) восстанавливается в печени NADPHзависимой витамин К редуктазой с образованием дигидрохинона витамина К. В ходе реакции кар-боксилирования остатков глутаминовой кислоты в проферментах прокоагулянтного пути дигидрохинон окисляется и эпоксидируется с образованием 2,3-эпоксида витамина К. Регенерация эпоксида в дигидрохинон витамина К происходит следующим образом: сначала 2,3-эпоксид витамина К восстанавливается в витамин К тиолзависимой эпоксидредуктазой, коферментом которой является белок, подобный тиоредоксину. Затем образующийся в этой реакции витамин К восстанавливается ферментом витамин К тиолзависимой редуктазой в дигидрохинон витамина К. Донором водорода в этой реакции, так же, как и в предыдущей, служит тиоредоксинподобный белок. Недостаточность витамина К приводит к нарушению карбоксилирования проферментов прокоагулянтного пути и сопровождается кровоточивостью, подкожными и внутренними кровоизлияниями. Структурные аналоги витамина К дикумарол и варфарин ингибируют тиолзависимые ферменты витамин К 2,3-эпоксидредуктазу и витамин К редуктазу, вызывая торможение свёртывания крови

Инициация каскада реакций прокоагулянтного пути. Ферментные мембранные комплексы прокоагулянтного пути образуются только при наличии на внешней поверхности плазматической мембраны клеток тканевого фактора и отрицательно заряженных фосфолипидов. Поперечная асимметрия плазматических мембран, в частности, определяется преобладанием в наружном слое нейтральных фосфолипидов (фосфатидил-холина и сфингомиелина), а во внутреннем - отрицательно заряженных (фосфатидилинозитол-бисфосфата и фосфатидилсерина). Специальная ферментная сисгема обеспечивает трансмембранный перенос и такое распределение фосфолипидов в клеточных мембранах, при котором в норме внешняя поверхность плазматических мембран клеток не заряжена. При нарушении поперечной асимметрии мембран тромбоцитов и эндотелиальных клеток на их поверхности формируются отрицательно заряженные (тромбогенные) участки и экспонируется апопротеин III тканевого фактора. Такие нарушения могут возникнуть при физической травме. В этом случае тканевый фактор и внутренняя поверхность клеточной мембраны становятся доступными для плазменных факторов прокоагулянтного пути. Кроме того, взаимодействие сигнальных молекул, вызывающих тромбогенез, с рецепторами эндотелиальных клеток и тромбоцитов активирует Са2+-зависимые регуляторные системы. В конечном итоге это приводит к повышению содержания в цитоплазме Са2+, который ингибирует АТФ-зависимую аминофосфолипидтранслоказу. Этот фермент играет важную роль в сохранении поперечной асимметрии мембран, так как переносит фосфа-тидилсерин из внешнего липидного слоя во внутренний. Снижение активности аминофосфолипидтранслоказы приводит к увеличению содержания во внешнем слое клеточной мембраны фосфатидилсерина и образованию отрицательно заряженных участков, необходимых для формирования мембранных ферментных комплексов. Кроме того, в результате такого нарушения структуры плазматической мембраны на её внешней поверхности экспонируется тканевый фактор и формируется первый ферментный комплекс прокоагулянтного пути свёртывания крови VII-ТФ-Са2+. Активация ферментов каждого комплекса - результат взаимодействия всех его компонентов. Если факторы IX, X и II требуют активации, то фактор VII обладает невысокой протеолитической активностью. Фактор VII мембранного комплекса VII-ТФ-Са2+ частичным протеолизом активирует факторы IX и X. Активные факторы IХа и Ха включаются в образование мембранных комплексов IXa-VIIIa-Са2+ и Ха-Va-Са2+. При этом фактор Ха протеолитически активирует фактор V, а протромбиназный комплекс не только превращает протромбин в тромбин, но и активирует фактор VII, протеолитическая активность которого в комплексе VIIa-Тф-Са2+ в 10 000 раз выше, чем в комплексе VII-Тф-Са2+. Образовавшийся в результате каскада реакций тромбин катализирует реакции частичного протеолиза фибриногена, фактора XIII и по принципу положительной обратной связи протеолитически активирует факторы V, VII и VIII. В процессе свёртывания действуют 2 механизма усиления сигнала: каскад реакций, в котором каждое ферментативное звено обеспечивает усиление сигнала, и положительные обратные связи.

147. Основные механизмы фибринолиза. Активаторы плазминогена как тромболитические средства. Основаные антикоагулянты крови: антитромбин III, макроглобулин, антиконвертин. Гемофилии.

Тромб растворяется в течение нескольких дней после образования. Фибринолиз - ферментативное расщепление волокон фибрина с образованием растворимых пептидов, которые удаляются из сосудистого русла. Разрушение фибрина в составе тромба происходит под действием сериновой протеазы плазмина.

Плазмин образуется из плазминогена под действием активаторов. Неактивный профермент плазмина плазминоген синтезируется в печени, почках и костном мозге.

Тканевый активатор плазминогена ТАЛ) - протеолитический фермент, содержащийся в эндотелии сосудов всех тканей, кроме печени. Поступление этого активатора в кровь увеличивается при эмоциональном напряжении, боли, венозной тромбоэмболии, умеренной физической работе. ТАЛ частичным протеолизом превращает неактивный плазминоген в активный плазмин. Активаторами плазминогена также служат фактор ХIIа и калликреин.

Растворение фибринового сгустка происходит при взаимодействии фибрина, плазминогена и ТАП Формирование сети фибриновых волокон при образовании тромба сопровождается сорбцией на ней плазминогена и его активаторов. В молекуле плазмина и плазминогена есть участки, комплементарные доменам фибрина, причём одна молекула плазмина может связывать несколько молекул фибрина. Молекулы ТАП тоже имеют центры связывания с фибрином. Образующийся из плазминогена под действием ТАП плазмин гидролизует фибрин с образованием пептидов X и Y, активирующих фибринолиз, и пептидов D и E, его тормозящих. Растворимые пептиды X, Y, D, E поступают в кровоток и там фагоцитируются. Разрушение тромба приводит к освобождению из него плазмина и ТАП. В кровяном русле последние быстро инактивируются специфическими ингибиторами и улавливаются печенью. ТАП ингибируется ингибиторами тканевого активатора плазмина первого (и-ТАП-1) и второго (и-ТАП-2) типов, а плазмин - α2- антиплазмином или другими ингибиторами сериновых протеаз. В почках синтезируется протеолитический активатор плазминогена урокиназа, которая, превращая плазминоген в плазмин, способствует освобождению почечных клубочков от фибриновых волокон. Из β-гемолитического стрептококка выделили белок стрептокиназу, образующий комплекс с плазминогеном, в котором плазминоген аутокаталитически превращается в плазмин. Урокиназу, стрептокиназу и ТАП используют при тромболитической терапии инфаркта миокарда, тромбозах вен и артерий, гемодиализе. Такие ингибиторы ферментов свёртывания крови, как α2-макроглобулин, α1-антитрипсин и комплекс антитромбин III-гепарин также обладают небольшой фибринолитической активностью. Снижение фибринолитической активности крови сопровождается тромбозами. Нарушение разрушения фибринового сгустка может быть вызвано наследственным дефицитом плазминогена или генетическим дефектом его структуры, снижением поступления в кровь активаторов плазминогена, повышением содержания в крови ингибиторов фибринолиза (и-ТАП-1, и-ТАП-2, α2- антиплазмина). Наследственные и приобретённые нарушения гемостаза могут привести как к геморрагическим заболеваниям, характеризующимся кровоточивостью, так и к тромботической болезни. Однако следует отметить, что повышенная склонность к тромбообразованию и внутрисосудистому свёртыванию (тромбофилии) встречается гораздо чаще, чем гемофилии. Например, частота разных форм гемофилии колеблется в разных странах от 6 до 18 на 100 000 мужчин, в то время как тромбофилии, вызванные дефицитом антитромбина III, встречаются у 1-2 больных на 5000, а при недостатке протеина С - у одного на 15 000 человек.

Ингибиторы ферментов свёртывания крови. Физиологические ингибиторы ферментов свёртывания крови ограничивают распространение тромба местом повреждения сосуда.

Белок плазмы крови антитромбин III - наиболее сильный ингибитор свёртывания крови; на его долю приходится около 80-90% антикоагулянтной активности крови. Он инактивирует ряд сериновых протеаз крови: тромбин, факторы IХа, Ха, ХIIа, калликреин, плазмин и урокиназу. Антитромбин III не ингибирует фактор VIIIa и не влияет на факторы в составе мембранных комплексов, а устраняет ферменты, находящиеся в плазме крови, препятствуя распространению тромбообразования в кровотоке. Взаимодействие антитромбина с ферментами свёртывания крови ускоряется в присутствии гепарина. Гепарин - гетерополисахарид, который синтезируется в тучных клетках. В результате взаимодействия с гепарином антитромбин III приобретает конформацию, при которой повышается его сродство к сериновым протеазам крови. После образования комплекса антитромбин III-гепарин-фермент гепарин освобождается из него и может присоединяться к другим молекулам антитромбина. При наследственном дефиците антитромбина III в молодом возрасте наблюдают тромбозы и эмболии сосудов, опасные для жизни.

α2-Макроглобулин образует комплекс с сериновыми протеазами крови. В таком комплексе их активный центр полностью не блокируется, они могут взаимодействовать с субстратами небольшого размера. Однако высокомолекулярные субстраты, например фибриноген, становятся недоступными для действия протеаз в комплексе α2-макроглобулинтромбин.

Антиконвертин тканевый ингибитор внешнего пути свёртывания) синтезируется в эндотелии сосудов. Он специфически соединяется с ферментным комплексом Тф-VIIа-Са2+, после чего улавливается печенью и разрушается в ней.

α1-Антитрипсин ингибирует тромбин, фактор ХIа, калликреин, однако он не рассматривается как важный ингибитор факторов свёртывания крови, α1-Антитрипсин в основном на тканевом уровне ингибирует панкреатические и лейкоцитарные протеазы, коллагеназу, ренин, урокиназу. Пептиды, образующиеся в результате протеолитической активации проферментов и профакторов, тоже обладают выраженными антикоагулянтными свойствами, но механизм их действия в настоящее время не выяснен.

Гемофилия — наследственное заболевание, связанное с нарушением коагуляции (процессом свёртывания крови); при этом заболевании возникают кровоизлияния в суставы, мышцы и внутренние органы, как спонтанные, так и в результате травмы или хирургического вмешательства. При гемофилии резко возрастает опасность гибели пациента от кровоизлияния в мозг и другие жизненно важные органы, даже при незначительной травме. Больные с тяжёлой формой гемофилии подвергаются инвалидизации вследствие частых кровоизлияний в суставы (гемартрозы) и мышечные ткани (гематомы). Гемофилия относится к геморрагическим диатезам, обусловленным нарушением плазменного звена гемостаза (коагулопатия).

Гемофилия появляется из-за изменения одного гена в хромосоме X. Различают три типа гемофилии (A, B, C).

Гемофилия А (рецессивная мутация в X-хромосоме) вызвана генетическим дефектом, отсутствием

в крови необходимого белка — так называемого фактора VIII (антигемофильного глобулина). Такая гемофилия считается классической, она встречается наиболее часто, у 80-85 % больных гемофилией. Тяжёлые кровотечения при травмах и операциях наблюдаются при уровне VIII фактора — 5-20 %.

Гемофилия B вызвана дефектным фактором крови IX (рецессивная мутация в X-хромосоме). Нарушено образование вторичной коагуляционной пробки.

Гемофилия С вызвана дефектным фактором крови XI (аутосомная рецессивная мутация), известна в основном

у евреев-ашкеназов. В настоящее время гемофилия С исключена из классификации, т.к. ее клинические проявления значительно отличаются от А и В.

Обычно болезнью страдают мужчины (наследование, сцепленное с полом), женщины же выступают как носительницы гемофилии, которые сами ей обычно не болеют, но могут родить больных сыновей или дочерей-носительниц.

148. Клиническое значение биохимического анализа крови.

Среди медицинских анализов особенное значение имеет анализ крови — связующего звена между всеми системами и органами тела. Распространенным лабораторным методом изучения ее состава является биохимический анализ крови.

Большое число параметров позволяет составить их оптимальный набор для конкретного пациента. Он может зависеть от жалоб больного, его общего состояния, выбора той системы органов, работу которой прежде всего следует проверить по мнению врача. В связи со своей универсальностью биохимический анализ крови назначается врачами разных медицинских специальностей — терапевтами, кардиологами, гастроэнтерологами, ревматологами и другими. Он позволяет оценить функциональное состояние практически всех систем органов.

Биохимический анализ крови включает следующие основные группы показателей:

обмен белков (общий белок, альбумин, креатинин, мочевина, мочевая кислота)

обмен липидов и липопротеинов (триглицериды, холестерин, аполипопротеин)

обмен углеводов (глюкоза, фруктозамин)

обмен пигментов (билирубин, желчные кислоты)

специфические белки ( С-реактивный белок, трансферрин, миоглобин, ферритин, тропонин)

ферменты (фосфотаза, амилаза, липаза)

электролиты (К, Na, Mg, Fe, Cl, P, Cu, Zn)

витамины

149. Основные мембраны клетки и их функции. Общие свойства мембран: жидкостность, поперечная асимметрия, избирательная проницаемость.

Все клетки имеют мембраны. Кроме того, почти во всех эукариотических клетках существуют органеллы, каждая из которых имеет свою мембрану. Мембраны ответственны за выполнение многих важнейших функций клетки. Согласованное функционирование мембранных систем - рецепторов, ферментов, транспортных механизмов помогает поддерживать гомеостаз клетки и в то же время быстро реагировать на изменения внешней среды.

Косновным функциям мембран можно отнести:

отделение клетки от окружающей среды и формирование внутриклеточных компартментов(отсеков);

контроль и регулирование транспорта огромного разнообразия веществ через мембраны;

участие в обеспечении межклеточных взаимодействий, передаче внутрь клетки сигналов;

преобразование энергии пищевых органических веществ в энергию химических связей молекул АТФ.

Основные принципы структурной организации всех мембран одинаковы, однако одна из самых характерных особенностей - огромное их разнообразие. Мембраны органелл эукариотических клеток уникальны по своему составу и по характеру выполняемых функций.

Плазматическая мембрана. Плазматическая мембрана, окружающая каждую клетку, определяет её величину, обеспечивает транспорт малых и больших молекул из клетки и в клетку, поддерживает разницу концентраций ионов по обе стороны мембраны. Мембрана участвует в межклеточных контактах, воспринимает, усиливает и передаёт внутрь клетки сигналы внешней среды. С мембраной связаны многие ферменты, катализирующие биохимические реакции.

Ядерная мембрана. Ядерная оболочка состоит из внешней и внутренней ядерных мембран. Ядерная оболочка имеет поры, через которые РНК проникают из ядра в цитоплазму, а регуляторные белки из цитоплазмы в ядро.Внутренняя ядерная мембрана содержит специфические белки, имеющие участки связывания основных полипептидов ядерного матрикса - ламина А, ламина В и ламина С. Важная функция этих белков - дезинтеграция ядерной оболочки в процессе митоза.

Мембрана эндоплазматического ретикулума ЭР). Мембрана ЭР имеет многочисленные складки и изгибы. Она образует непрерывную поверхность, ограничивающую внутреннее пространство, называемое полостью ЭР. Шероховатый ЭР связан с рибосомами, на которых происходит синтез белков плазматической мембраны, ЭР, аппарата Гольджи, лизосом, а также секретируе-мых белков. Области ЭР, не содержащие рибосом, называют гладким ЭР. Здесь происходит завершающий этап биосинтеза холестерина, фосфолипидов, реакции окисления собственных метаболитов и чужеродных веществ с участием мембранных ферментов - цитохрома Р450, цитохром Р450 редуктазы, цитохром b5 редуктазы и цитохрома b5.

Аппарат Гольджи. Аппарат Гольджи - важная мембранная органелла, отвечающая за модификацию, накопление, сортировку и направление различных веществ в соответствующие внутриклеточные компартменты, а также за пределы клетки. Специфические ферменты мембраны комплекса Гольджи, гликозилтрансферазы, гликозилируя белки по остаткам серина, треонина или амидной группе аспарагина, завершают образование сложных белков - гликопротеинов.

Митохондриальные мембраны. Митохондрии - органеллы, окружённые двойной мембраной, специализирующиеся на синтезе АТФ путём окислительного фосфорилирования. Отличительная особенность внешней митохондриальной мембраны - содержание большого количества белка порина, образующего поры в мембране. Благодаря порину внешняя мембрана свободно проницаема для неорганических ионов, метаболитов и даже небольших молекул белков (меньше 10 кД). Для больших белков внешняя мембрана непроницаема, это позволяет митохондриям удерживать белки межмембранного пространства от утечки в цитозоль.Для внутренней мембраны митохондрий характерно высокое содержание белков, около 70%, которые выполняют в основном каталитическую и транспортную функции. Транслоказы мембраны обеспечивают избирательный перенос веществ из межмембранного пространства в мат-рикс и в обратном направлении, ферменты участвуют в транспорте электронов (цепи переноса электронов) и синтезе АТФ. Подробно строение и функционирование ферментов цепи переноса электронов рассмотрено в разделе 6.

Мембрана лизосом. Мембрана лизосом играет роль "щита" между активными ферментами (более 50), обеспечивающими реакции распада белков, углеводов, жиров, нуклеиновых кислот, и остальным клеточным содержимым. Мембрана содержит уникальные белки, например АТФ-зависимую протонную помпу (насос), которая

поддерживает кислую среду (рН 5), необходимую для действия гидролитических ферментов (протеаз, липаз), а также транспортные белки, позволяющие продуктам расщепления макромолекул покидать лизосому. Большинство белков лизосомальной мембраны сильно гликозилированы, углеводные составляющие, находящиеся на внутренней поверхности мембраны, защищают их от действия протеаз.

Каждая мембрана клетки замкнута, т.е. имеет внутреннюю и внешнюю поверхности, различающиеся по липидному и белковому составам - эту особенность мембран называют трансмембранной асимметрией.Липидная асимметрия возникает прежде всего потому, что липиды с более объёмными полярными "головками" стремятся находиться в наружном монослое, так как там площадь поверхности, приходящаяся на полярную "головку", больше. Фосфатадилхолины и сфингомиелины локализованы преимущественно в наружном монослое, а фосфатидилэтаноламины и фосфатидилсерины в основном во внутреннем. Липиды в некоторых биологических мембранах с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую, т.е. совершают "флипфлоп" (от англ, flip-flop) перескоки Перемещение липидных молекул затрудняют полярные "головки", поэтому липиды, находящиеся на внутренней стороне мембраны, имеют относительно высокую скорость трансмембранной миграции по сравнению с липидами наружной стороны мембраны, мигрирующих медленнее или вообще не совершающими "флип-флоп" перескоки.

Жидкостностъ мембран. Для мембран характерна жидкостность (текучесть), способность липидов и белков к латеральной диффузии. Скорость перемещения молекул зависит от микровязкости мембран, которая, в свою очередь, определяется относительным содержанием насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в составе липидов. Микровязкость меньше, если в составе липидов преобладают ненасыщенные жирные кислоты, и больше при высоком содержании насыщенных жирных кислот. Ацильные (алифатические) остатки ненасыщенных жирных кислот имеют так называемые "изломы". Эти "изломы" препятствуют слишком плотной упаковке молекул в мембране и делают её более рыхлой, а следовательно и более "текучей". На текучесть мембран также влияют размеры углеводородных "хвостов" липидов, с увеличением длины которых мембрана становится более "текучей".

150. Липидный состав мембран (фосфолипиды, гликолипиды, холестерин). Роль липидов в формировании липидного бислоя.

Основу мембраны составляет двойной липидный слой в формировании которого участвуют фосфолштиды и гликолипиды. Липидный бислой образован двумя рядами липидов, гидрофобные радикалы которых спрятаны внутрь, а гидрофильные группы обращены наружу и контактируют с водной средой. Белковые молекулы как бы "растворены" в липидном бислое Мембранные липиды - амфифильные (амфипатические) молекулы т.е. в молекуле есть как гидрофильные группы (полярные "головки"), так и алифатические радикалы (гидрофобные "хвосты"), самопроизвольно формирующие бислой. В большинстве эукариотических клеток они составляют около 30-70% массы мембраны. В мембранах присутствуют липиды трёх главных типов - фосфолипиды, гликолипиды и холестерол (холестерин). Липидный состав мембран различен, содержание того или другого липида, по-видимому, определяется разнообразием функций, выполняемых этими липидами в мембранах.

Фосфолипиды. Все фосфолипиды можно разделить на 2 группы - глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды. Глицерофосфолипиды относят к производным фосфатидной кислоты. Наиболее распространённые глицерофосфолипиды мембран - фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины. В мембранах эукариотических клеток обнаружено огромное количество разных фосфолипидов, причём они распределены неравномерно по разным клеточным мембранам. Эта неравномерность относится к распределению как полярных "головок", так и ацильных остатков. Каждый глицерофосфолипид, например фосфатидилхолин, представлен несколькими десятками фосфатидилхолинов, отличающихся друг от друга строением жирно-кислотных остатков На долю глицерофосфолипидов (полярная группа - инозитол) приходится лишь 2-8% всех фосфолипидов, содержащихся в клеточной мембране эукариотов. Инозитол в составе фосфати-дилинозитолов может быть фосфорилирован по С4 (фосфатидилинозитол-4-монофосфат) или С4 и С5(фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат) В состав фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатов входят в основном ацильные остатки стеариновой или пальмитиновой (по первому положению глицерола) и арахидоновой (по второму положению) жирных кислот. Специфические фосфолипиды внутренней мембраны митохондрий - кардиолипины (дифосфатидилглицеролы), построенные на основе глицерола и двух остатков фосфатид-ной кислоты. Они синтезируются ферментами внутренней мембраны митохондрий и составляют около 22% от всех фосфолипидов мембраны. В плазматических мембранах клеток в значительных количествах содержатся сфингомие-лины. Сфингомиелины построены на основе церамида - ацилированного аминоспирта сфингозина. Полярная группа состоит из остатка фосфорной кислоты и холина, этаноламина или серина. Сфингомиелины - главные липиды миелиновой оболочки нервных волокон.

Гликолипиды. В гликолипидах гидрофобная часть представлена церамидом. Гидрофильная группа - углеводный остаток, присоединённый гликозидной связью к гидроксильной группе у первого углеродного атома церамида. В

зависимости от длины и строения углеводной части различают цереброзиды содержащие моноили олигосахаридный остаток, и ганглиозиды к ОН-группе которых присоединён сложный, разветвлённый олигосахарид, содержащий N-ацетилнейраминовую кислоту (NANA). Полярные "головки" гликосфинголипидов находятся на наружной поверхности плазматических мембран. В значительных количествах гликолипиды содержатся в мембранах клеток мозга, эритроцитов, эпителиальных клеток. Ганглиозиды эритроцитов разных индивидуумов различаются строением олигосахаридных цепей, проявляющих антигенные свойства.

Холестерол. Холестерол присутствует во всех мембранах животных клеток. Его молекула состоит из жёсткого гидрофобного ядра и гибкой углеводородной цепи, единственная гидроксильная группа является "полярной головкой". Для животной клетки среднее молярное отношение холестерол/фосфолипиды равно 0,3-0,4, но в плазматической мембране это соотношение гораздо выше (0,8-0,9). Наличие холестерола в мембранах уменьшает подвижность жирных кислот, снижает латеральную диффузию липи-дов и белков, и поэтому может влиять на функции: мембранных белков. В составе мембран растений холестерола нет, а присутствуют растительные стероиды - ситостерол и стигмастерол.

151. Белки мембран - интегральные, поверхностные, «заякоренные». Значение посттрансляционных модификаций в образовании функциональных мембранных белков.

Мембранные белки, контактирующие с гидрофобной частью липидного бислоя, должны быть амфифильными. Те участки белка, которые взаимодействуют с углеводородными цепями жирных кислот, содержат преимущественно неполярные аминокислоты. Участки белка, находящиеся в области полярных "головок", обогащены гидрофильными аминокислотными остатками. Белки мембран различаются по своему положению в мембране. Они могут глубоко проникать в липидный бислой или даже пронизывать его - интегральные белки либо разными способами прикрепляться к мембране - поверхностные белки.

Поверхностные белки. Поверхностные белки часто прикрепляются к мембране, взаимодействуя с интегральными белками или поверхностными участками липидного слоя.

Белки образующие комплексы с интегральными белками мембраны. Ряд пищеварительных ферментов,

участвующих в гидролизе крахмала и белков, прикрепляется к интегральным белкам мембран микроворсинок кишечника. Примерами таких комплексов могут быть са-хараза-изомальтаза и мальтаза-гликоамилаза. Возможно, связь этих пищеварительных ферментов с мембраной позволяет с высокой скоростью гидролизовать субстраты и усваивать продукты гидролиза клеткой.

Белки связанные с полярными «головками» липидов мембран. Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут взаимодействовать с полярными "головками" липидов, образуя ионные и водородные связи. Кроме того, множество растворимых в цитозоле белков при определённых условиях могут связываться с поверхностью мембраны на непродолжительное время. Иногда связывание белка - необходимое условие проявления ферментативной активности. К таким белкам, например, относят протеинкиназу С, факторы свёртывания крови.

Закрепление с помощью мембранного "якоря". "Якорем" может быть неполярный домен белка, построенный из аминокислот с гидрофобными радикалами. Примером такого белка может служить цитохром b5 мембраны ЭР. Этот белок участвует в окислительно-восстановительных реакциях, как переносчик электронов Роль мембранного "якоря" может выполнять также ковалентно связанный с белком остаток жирной кислоты (миристиновой - С14 или пальмитиновой - С16). Белки, связанные с жирными кислотами, локализованы в основном на внутренней поверхности плазматической мембраны. Миристиновая кислота присоединяется к N-концевому глицину с образованием амидной связи. Пальмитиновая кислота образует тиоэфирную связь с цистеином или сложноэфирную с остатками серина и треонина. Небольшая группа белков может взаимодействовать с наружной поверхностью клетки с помощью ковалентно присоединённого к С-концу белка фосфатидилинозитолгликана. Этот "якорь" - часто единственное связующее звено между белком и мембраной, поэтому при действии фосфолипазы С этот белок отделяется от мембраны.

Трансмембранные интегральные) белки. Некоторые из трансмембранных белков пронизывают мембрану один раз (гликофорин), другие имеют несколько участков (доменов), последовательно пересекающих бислой Трансмембранные домены, пронизывающие бислой, имеют конформацию α-спирали. Полярные остатки аминокислот обращены внутрь глобулы, а неполярные контактируют с мембранными липидами. Такие белки называют "вывернутыми" по сравнению с растворимыми в воде белками, в которых большинство гидрофобных остатков аминокислот спрятано внутрь, а гидрофильные располагаются на поверхности. Радикалы заряженных аминокислот в составе этих доменов лишены заряда и протонированы (-СООН) или депротонированы (-NH2)