§ I. А). Опыт трансдукции.

К I мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е.соli1ас^— добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас, в концентрации 10⁶-10⁷ . Смесь инкубируют при 37⁰ в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без шага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е.coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺ , met^-,str^s, (str^s- чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^-с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину) .

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1.0 г; стрептомицина - 200 ед/мл; NH₄Cl- 1,0 г; NaС1- 0,5 г;Na₂HРO₄ - 6,0 г; КH₂PO₄- 3,0 г;Mg₂SO₄-0,2 г; дистиллированной воды - 170 л. Для тех же целей может быть испо­льзована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавля­ется 20,0 г. агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты. Культуры донор-ного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиен­та добавляют I мл 3- часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37° . Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину. Чашки с посевом зарисовать.

Результаты опыта трансдукции

Рост лактозопозитивных колоний на среде Эндо

Рис.1 Опыт

Рис.2 Контроль

Результаты опыта по конъюгации.

Рост на голодной среде со стрептомицином.

Рис.3 Донор

Рис.4 Рекомбинант

Рис.5 Реципиент

Контрольные вопросы

Что такое ген?

Что таков мутации спонтанные и индуцированные?

Каков молекулярный механизм мутации?

Какие вы знаете мутагены?

Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

Каков механизм генетических рекомбинаций?

Что такое трансформация?

Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?

Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?

Как производят картирование хромосом?

Что такое плазмида?

Какие известны классы плазмид?

Каковы основные свойства плазмид?

Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?

Каковы основные функций F-фактора?

В чем заключается механизм конъюгации бактерий?

Что такое бактериоцины?

Каковы основные свойства Соl -плазмид?

Какими свойствами обладают R-плазмиды?

Как определяют конъюгативные свойства плазмид?

Как получают рекомбинантные молекулы ДНК?

Что такое генетический вектор?

Как у бактерий можно обнаружить плазмиды?

В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?

Приложение к занятию 13

Определение понятия ген

Ген - универсальная организующая структурная единица живой материи, которая благодаря содержащейся в ней закодированной информа­ции обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию.

Ген - основной носитель и хранитель жизни, а его продукт - бе­лок - способ ее существования (А.И.Коротяев, Т.В.Малышева).

Основные формы обмена генетическим материалом у бактерий

1.Конъюгация - обмен хромосомными и плазмидными генами путем установления контакта между донорной и реципиентной клетками с помощью донорных ворсинок.

Механизм конъюгации контролируется конъюгативными (донорными) плазмидами.

2.Трансдукция - перенос генов от донорной клетки в реципиентную с помощью фагов.

3.Сексдукция - перенос генов от донорной клетки в реципиентную с помощью F-фактора (полового фактора).

4.Трансформация - поглощение компетентными клетками внеклеточной ДНК.

5.Трансфекция - поглощение протопластами свободной фаговой ДНК.

Плазмиды -наипростейшие живые существа, лишенные белковой оболочки и представленные только совокупностью организованных генов, определяющих их специфические свойства, наследственность, а также дополнительные признаки, которыми они наделяют клеткуносителя.

Плазмиды подразделяются на конъюгативные, т,е. способные к са­мопереносу, и неконъюгативные, перенос которых осуществляется конъюгативными плазмидами.

Передача плазмид среди бактерий происходит как по вертикали, так и по горизонтали, обеспечивая их эпидемическое распространение.

Специфические функции плазмид

1.Саморепликация.

2.Конъюгативность, или способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид).

3.Мобилизуемоеть, или способность к мобилизации на перенос конъюгативными плазмидами (у неконъюгативных плазмид).

4.Контроль явления несовместимости.

5.Контроль явления поверхностного исключения.

6.Контроль числа копий на хромосому клетки - хозяина.

7.Контроль стабильности поддержания и распределения между дочерними клетками.

8.Способность наделять клетку-хозяина дополнительными важны­ми селективными свойствами. Фенотипические проявления этих свойств определяют класс плазмид.

Классы плазмид

КЛАСС	ФУНКЦИЯ
F-плазмиды	Донорные функции
R-плазмиды	Устойчивость к лекарственным препаратам
Col-плазмиды	Синтез колицинов
Ent-плазмиды	Синтез энтеротоксинов и факторов адгезии
Hly-плазмиды	Синтез гемолизинов
Биодеградативные плазмиды	Разрушение различных органических соединений

Inc – группы, выявленные среди плазмид энтеробактерий.

Группа	Прототипная плазмида	Группа	Прототипная плазмида
IncB	TPI13	IncIα (IncII, IncIβ)	R64
IncC	R40a (pIP40a)	IncI2	TP114
IncD	R711b	IncIγ	R621a
IncE	pJa4620	IncIδ	R821a
IncFI тип 1	F	IncIε	R805a
IncFI тип 2	R162	IncJ	R391
IncFI тип 3	TP181 (FIme)	IncK	R387
IncFII	R1	IncM	R446b
IncFIII	ColB-K98	IncN	N3 (RN3)
IncFIV	R124	IncP	RP4
IncFV	pIe509	IncQ	R678
IncFVI	Hly-P212	IncT	Rts-1
IncFVII	pAP38	IncU	RA3
IncFVIII	pAP43	IncV	R753
IncFIX	pAP42	IncW	S-a
IncFX	pAP19-1	IncX	R6K
IncG	Rms149	IncY	φAmp-PlCm
IncH1	R27 (TP117)	IncZ	pIE544
IncH2	R478	Inc9	R71a
IncH3	MIP233

Примечание: Inc – группа соответствует биологическому виду.

Рис.6 Молекулярная организация плазмиды pKMI0I.

Конъюгативная плазмида pKM101 IncN группы является производной плазмиды R46, у которой утрачена область генов, контролирующая устойчивость к антибиотикам. Широко используется для изучения механизмов генетической регуляции плазмидных функций.