Автореферат-Ермаковой+АВ-19_11_13-1

таксономической принадлежности бактерий, использующих пропионат или бутират и составляющих психроактивный и мезофильный консорциумы.

Путем амплификации генов 16S рРНК с универсальными бактериальными праймерами и последующим сиквенированием вырезанных после ДГГЭ полос, был получен ряд последовательностей, близких к генам 16S рРНК известных бактерий – пропионат-окислящей бактерии Smithella propionica (97%), бутират-окисляющей бактерии Syntrophomonas bryantii (96%), сахаролитикам Macellibacteroides fermentans

(98%) и Acetivibrio multivorans (81%). Кроме того, консорциумы содержали последовательности бактерий, родственных некультивируемым микроорганизмам, обнаруженным ранее в низкотемпературных природных (Арктика, Антарктика) и антропогенных (психрофильные анаэробные биореакторы, низкотемпературное нефтяное хранилище) местах обитания (табл. 1, 2).

Полученные результаты позволяют предположить, что ряд бактерий в исследованных нами консорциумах принадлежит к новым таксонам.

4.2.Исследование архейной составляющей консорциумов

Методом ДГГЭ с универсальными архейными праймерами нами была проанализирована архейная составляющая пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов. В обоих консорциумах были выявлены последовательности гена 16S

рРНК Methanosaeta (99-100% сходства с M. concilii), Methanospirillum (97.5% сходства с M. hungatei) и Methanomethylovorans (98-99% сходства с M. hollandica). Полученные результаты позволили нам предположить, что археон со сходством последовательности гена 16S рРНК 97.5% с геном 16S рРНК M. hungatei может являться новым видом

Methanospirillum.

10

5.Выделение и описание нового гидрогенотрофного метаногена Methanospirillum stamsii sp. nov. штамм Pt1T

Из пропионат-окисляющего консорциума методом серийных разведений, использованием антибиотиков и получением отдельных колоний на твердой агаризованной среде была выделена и описана чистая культура первого психроактивного гидрогенотрофного метаногена из рода Methanospirillum – Methanospirillum stamsii Pt1T. Основные диагностические признаки приведены ниже.

Клетки штамма имеют форму изогнутых палочек, размером 0.4–0.5 х 7.5–25 мкм. Клетки образуют нити, которые иногда достигают в длину от 25 до нескольких сотен мкм (рис. 5 а). Клетки штамма подвижны за счет пучка полярно расположенных жгутиков (рис. 5 б). При высеве на агар штамм образует колонии светло-желтого цвета. Штамм Pt1T является строгим анаэробом.

Рис. 5.

Микрофотография клеток

Methanospirillum stamsii

Pt1T. Шкала 10 мкм (а).

Электронная фотография жгутиков клеток

Methanospirillum stamsii

Pt1T. Шкала 0.4 мкм (б).

Штамм Pt1T растет в диапазоне температур от 5 до 37°С с оптимумом роста и метанообразования при 20–30°С (рис. 6 а). Диапазон рН для роста составляет 6.0–10.0 с оптимумом 7.0–7.5 (рис. 6 б). Рост штамма Pt1T детектируется в интервале от 0 до 0.3М NaCl. Оптимальный рост наблюдается в отсутствие NaCl в среде.

Рис. 6. Максимальные скорости образования метана штаммом Pt1Т при разных температурах инкубации (а) и в средах при разном значении рН при температуре 25°С (б).

Штамм Pt1Т использует для роста смесь H2/СO2 (4:1). На ацетате, пирувате, метаноле,

13

этаноле, бутаноле и метиламинах (10 ммоль/л) не растет. На формиате (10 ммоль/л) наблюдается очень слабый рост. Ацетат (2 ммоль/л) и дрожжевой экстракт (1 г/л) оказывают стимулирующее действие на рост штамма. Штамм Pt1Т чувствителен к циклосерину и канамицину, однако резистентен к пенициллину, ампициллину, эритромицину, ванкомицину и рифампицину.

Филогенетический анализ, основанный на сравнении генов 16S рРНК исследуемого штамма и родственных организмов, показал низкий уровень сходства с Methanospirillum hungatei JF1T (97.5%) и еще более низкий уровень сходства с

Methanospirillum lacunae Ki8-1T (94%) (рис.7).

Рис. 7. Филогенетическое положение штамма Pt1Т на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей. Цифрами показаны значения индекса “bootstrap” более 50%. В корне дерева Methanobacteria (не показано).

Анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена mcrA, также показал низкий уровень сходства с Methanospirillum hungatei JF1T (91%) и с Methanospirillum lacunae Ki8-1T (86%). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК 40 мол%. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов Methanospirillum stamsii Pt1Т и Methanospirillum hungatei JF1T составляет 39%. Совокупность физиологических и молекулярно-биологических характеристик штамма, позволяет отнести выделенный штамм к новому виду Methanospirillum stamsii Pt1Т (=DSM 26304Т, =VKM B-2808Т).

Ранее были выделены и описаны два вида метаногенов, относящихся к роду

Methanospirillum: Methanospirillum hungatei JF1T (Ferry et al., 1974) и Methanospirillum lacunae Ki8-1T (Iino et al., 2010). Представители этих видов являются мезофилами и не растут ниже 20°С (Methanospirillum hungatei) и 15°С (Methanospirillum lacunae). В

таблице 3 приведены сравнительные характеристики типовых штаммов рода

14

Methanospirillum. Штамм Pt1Т психроактивный – он имеет более низкий температурный предел и оптимум роста (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительные характеристики штамма Pt1Т, M. lacunae Ki8-1T и M. hungatei JF1T

6.Выделение и описание «Methanosarcina porcellina» sp. nov. штамм Pr1, Pr2T и их бактерии-спутника Sphaerochaeta sp. PS

Одной из задач нашего исследования было выделение психроактивных метаногенов из низкотемпературных мест обитания. Ранее Т.Н. Жилина и Г.А. Заварзин (1991) выделили из подмосковного болота штамм Methanosarcina sp. Z-7289, способный расти при температуре 6°С. Метаносарцина росла на ацетате, но не использовала Н2/СО2. Позже Паршиной и соавторами (1993) были получены накопительные культуры двух морфотипов метаносарцин из жидких стоков свинофермы, хранившихся в навозохранилище при среднегодовой температуре ниже 10°С, а также накопительная культура метаносарцины из донных осадков пресноводного озера. Все метаносарцины были способны расти при 1–5°С. Психроактивная сарцина, выделенная из донных осадков, названная Methanosarcina lacustris (Simankova et al., 2001), является единственной из десяти известных видов психроактивных метаногенов, выделенной из пресноводного источника и способной расти при температуре ниже 10°С на Н2/СО2. На данный момент ни один валидный психроактивный метаноген не был выделен из антропогенных мест обитания. Метаносарцины из свиного навоза представляют большой интерес, так как были обнаружены в низкотемпературном антропогенном месте обитания. Из накопительной культуры была выделена, но не описаны чистая

15

культура Methanosarcina sp. штамм Pr2 и монокультура Methanosarcina sp. штамм Pr1. В рамках настоящей работы автором диссертации методом серийных разведений, высевом на среду с агаром, пересевами с антибиотиками Methanosarcina sp. штамм Pr1 была выделена в чистую культуру.

6.1.Описание «Methanosarcina porcellina» sp. nov. Pr2T и штамма Рr1

Штаммы Pr1 и Pr2T растут в виде молочно-белых агрегатов на дне флаконов. Надосадочная жидкость остается прозрачной. Штамм Pr2Т образует более крупные агрегаты, чем штамм Pr1 (рис. 8 а), состоящие иногда из нескольких сотен плотно упакованных кокковидных клеток неправильной формы (рис. 8 б).

мкм.

Размер кокков в агрегатах штамма Pr1 составляет 1.5–3.5 мкм в диаметре, а штамм Pr2Т образует кокки 0.5–1.5 мкм в диаметре. При взбалтывании агрегаты легко разрушаются, в результате чего культуральная жидкость становится тонкодисперсной и мутно-белого оттенка, а осадок сравнительно долго оседает. При высеве на агаризованную среду штаммы формируют колонии бледно-желтого цвета. Диаметр колоний штамма Pr1 составляет 0.4–1.0 мм, а штамма Pr2Т - 0.5–1.5 мм. Оба штамма - строгие анаэробы, чувствительные к канамицину и хлорамфениколу.

Штаммы растут на монометиламине, диметиламине, триметиламине, метаноле, но не используют формиат, ацетат, лактат, пируват, кротонат, бетаин, пропионат, бутират, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, 1-бутанол, 2-бутанол. Штамм Pr1, в отличие от штамма Pr2Т, обладает способностью к росту на смеси H2/CO2.

Температурный диапазон метанообразования для штамма Pr1 составляет 1–30°С, с оптимумом при 21°С (рис. 9 а). При температуре 1°С наблюдается длинная лаг-фаза и низкая скорость метанообразования. При 35°С метан не образуется. Штамм Pr2Т образует метан в пределах температур от 5 до 35°С, с оптимумом при 25–30°С (рис. 9 б). При температурах 1 и 40°С метанобразования не происходит.

16

Штаммы Pr1и Pr2Т образуют метан при солености среды менее 0.4М NaCl и 0.2М NaCl соответственно. Оптимальная скорость метанообразования обоих штаммов наблюдается при 0 NaCl в среде. В сравнении со штаммом Pr1, штамм Pr2Т обладает более узкими диапазонами рН, температуры и содержания NaCl для роста и метанообразования.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК исследуемых штаммов показал 100% сходства друг с другом и 99.9% сходства с геном Methanosarcina lacustris ZSТ (рис. 11). Анализ последовательностей гена mcrA выделенных штаммов Pr1 и Pr2T также показал 100% сходства этих генов у обоих штаммов между собой и 99.5% сходства с геном mcrA типового штамма Methanosarcina lacustris ZSТ (подробнее в рукописи).

Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК штамма Pr1 составляет 45.6 мол%, а у штамма Pr2Т - 43.8 мол%. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов Pr1 и Pr2Т с ближайшим родственным микроорганизмом Methanosarcina lacustris ZSТ составляет 53

17

и 42% сходства с, соответственно. Уровень ДНК-ДНК гибридизации штамма Pr1 со штаммом Pr2Т 79%.

Рис. 11. Филогенетическое положение штамма Pr1 и штамма Pr2Т на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом ближайших соседей.

Штамм Methanosarcina sp. Pr1 был депонирован в международной коллекции (=VKM B-2807). Штамм Methanosarcina sp. Pr2Т был депонирован в международных коллекциях (=DSM 15218Т, =VKM B-2806Т).

Таблица 4. Сравнительные характеристики штаммов Pr1, Pr2Т и M. lacustris ZSТ

18